谷子PT2基因保守序列的克隆与分析

李 燕，杨致荣，高建华

（1.山西农业大学文理学院，山西 太谷 030801；2.山西农业大学生命科学学院，山西 太谷 030801）

谷子（Setaria italica）又称粟，是起源于我国的一种古老作物，也是我国过去几千年来的主栽作物和中华民族的哺育作物。近年来，随着人们生活水平的不断提高及食品多样化和营养化，小米及其制品备受青睐。提高谷子产量和品质也成为目前研究的热点。

对于水稻（Oryza sativa）等粮食作物而言，覆盖地膜[1]，喷施赤霉素[2]，不同氮肥组合和施肥方式[3]，提高籽粒大小、质量，防止成熟后落粒，均是促进产量的有效手段。目前，已经克隆出了多个籽粒性状相关基因如 GL7[4]，GW8[5]，GW7[6]和 GW2[7]等；落粒相关基因，如 qSH1[8]，SHAT1[9]，SH4[10]，PT2[11]和 SH5[12]等。其中，水稻PT2（Panicle Traits 2）基因编码蛋白，即生长调节因子Os GRF4（Growth Regulating Factor 4，Os02g47280）是拟南芥At GRF的同源蛋白。研究表明，Os GRF4能够调节细胞分裂素脱氢酶前体基因（CKX5和CKX1），导致细胞分裂素含量提高，进而调节籽粒大小、形状等。当Os GRF4表达受到抑制后，离层发育良好，从而增强了落粒性；反之，若Os GRF4高效表达，离层发育不完全，落粒性减弱[13]。PT2基因的表达受到miRNA的调控，第3个外显子中有一段miR396结合序列。当OsmiR396结合该位点时，PT2基因的表达被抑制；该结合位点的突变，导致OsmiR396无法结合，从而使PT2基因的表达量升高[14-15]。另外，作为一种调节因子，Os GRF4蛋白具有与核酸和其他蛋白质（比如，GRF-Interacting Factors，GIF）互作的结构域——WRC和QLQ。其中，WRC帮助Os GRF4蛋白与核酸互作，QLQ协助Os GRF4与其他蛋白互作[14-15]。另外，水稻Os04g51190基因编码序列与Os GRF4氨基酸序列同源性约70%，但目前未发现其与籽粒性状或落粒相关。

在豫谷1号的基因组数据（Setaria italica v2.2）中，有2个PT2基因的同源基因（Seita.1G287100.1和Seita.7G224500.1）。初步分析发现，这2个基因均含有相应的miR396结合序列，且其编码多肽也具有WRC和QLQ结构域。狗尾草（Setaria viridis）是谷子的近缘野生种，但二者在籽粒大小和落粒性等方面存在显著差异。

为了研究PT2基因与谷子籽粒性状及其落粒性的相关性，本研究首先分析了几种植物PT2基因的亲缘关系；预测了豫谷1号PT2基因启动子序列中的相关元件，并验证了PT2基因在豫谷1号不同部位的表达水平；筛选并比较了43种谷子和3种狗尾草中该基因的保守区域序列，旨在为后期筛选谷子落粒相关基因奠定了基础。

1 材料和方法

1.1 材料

本研究所用到的谷子和狗尾草材料列于表1。所有材料均种植于山西农业大学试验田。

表1 研究所用到的谷子和狗尾草种质资源

1.2 方法

1.2.1 PT2基因及其启动子的生物信息学分析从 phytozome网站（https://phytozome.jgi.doe.gov/）下载水稻PT2基因序列（LOC_Os02g47280），并下载拟南芥、水稻、谷子、狗尾草、高粱和玉米中与之同源性最高的基因序列。对这些基因编码的氨基酸序列进行同源性分析，并利用MEGA 7.0分析其亲缘关系。下载Seita.1G287100基因起始密码子上游1 500 bp的序列，在 PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）进行启动子在线预测。然后，对谷子和狗尾草PT2基因的启动子进行序列比对。

1.2.2 总RNA提取与PT2基因的检测 使用TaKaRa总RNA提取试剂盒（MiniBEST Plant RNA Extraction Kit，货号 9769S），按照说明书提取豫谷1号苗和穗的总RNA。然后使用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒（TaKaRa，货号RR047A）合成 cDNA。使用引物 579F（5′-CAGCGG CTTCCAGAACCACT）和 1179R（5′-GTTCGGCGAC TGAGAGCTTGCCA）检测Seita.1G287100.1基因的表达。

1.2.3 植物基因组DNA的提取 谷子和狗尾草基因组DNA提取使用CTAB法：CTAB提取液（200 mmol/L Tris-Cl，250 mmol/L NaCl，25 mmol/L EDTA和0.5%SDS，pH值7.5）65℃预热；在1.5 mL离心管中加入50mg幼嫩叶片，并加入500μLCTAB提取液，用高通量DNA研磨机（宁波新芝生物科技股份有限公司，型号SCIENTZ-48）充分研磨；放入65℃水浴温浴1 h，期间每隔5 min颠倒混匀；加入500 μL氯仿 /异戊醇（体积比 24∶1），振荡混匀，室温静置10 min；12 000 r/min离心10 min，取上清至新离心管；加入等体积氯仿/异戊醇（体积比24∶1），混匀后12 000 r/min离心10 min；取上清至新离心管，并加入0.7倍体积预冷的异丙醇，混匀后放入-20℃1 h；取出后12 000 r/min离心10 min，弃上清，并用70%乙醇清洗沉淀2次；室温晾干，加入30 μL ddH2O溶解DNA，最后-20℃保存备用。

1.2.4 PT2基因外显子的扩增及序列分析 根据数据库中Seita.1G287100基因序列，设计2对特异性引物，用于分别扩增不同谷子或狗尾草中PT2基因的前3个外显子序列。引物PT21-E12-F（5′-ACAAAGCGGGCAATAAAGGC）和PT21-E12-R（5′-ACACGGCAAGTATTCGGGAG）用于扩增外显子1和 2。引物 PT21-E3-F（5′-GTAGCTGCTCCAC TGTTCGC）和 PT21-E3-R（5′-AGTTATCTGCGTGA CCATCTCTG）用于扩增外显子3。PCR体系为：Takara Ex Taq premix （RR902A）10 μL，DNA 模板0.5μL，上下游引物各 0.5 μL，ddH2O补齐至 20 μL。PCR反应条件为：94℃预变性3 min；94℃，30 s，60 ℃，30 s，72℃，60 s，共 35 个循环；最后 72 ℃延伸5 min。PCR产物使用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，并克隆测序。使用MEGA 7.0对不同谷子和狗尾草的PT2基因序列进行同源性和单核苷酸多态性分析。

2 结果与分析

2.1 谷子PT2候选基因的筛选与分析

将数据库中谷子、狗尾草以及其他植物的PT2候选基因编码的蛋白质进行比对，并构建系统发育树。分析发现，已经报道的水稻Os GRF4蛋白（Os02g47280基因编码）[10-12]与谷子 Seita.1G287100、狗尾草Sevir.1G292200编码的蛋白质序列同源性较高（图1-A）。其中，谷子Seita.1G287100和狗尾草Sevir.1G292200编码的蛋白序列完全一致。该结果说明这2个基因分别是谷子和狗尾草的PT2基因。进一步分析3种植物的PT2蛋白质序列发现，QLQ结构域序列完全一致，而WRC结构域也仅存在一个氨基酸差异（图1-B）。该结果说明该生长调节因子中参与核酸或蛋白互作的2个重要位点高度保守，保障其正常执行功能。

2.2 谷子PT2基因启动子元件分析

将豫谷1号的PT2基因（Seita.1G287100）上游1 500 bp的序列进行在线分析，结果表明，该基因启动子较为复杂。除了常见的TATA-box，CAAT-box等核心启动子元件外，还有较多的响应元件，比如，光 应 答 响 应 元 件 ACE，AE-box，BOXI，G-BOX，G-box，GT1-motif，I-box，L-box，sp1，TCT-motif；脱落酸信号转导下游响应元件ABRE和motif-Iib；茉莉酸甲酯 （MeJA） 响应元件 CGTCA-motif和TGACG-motif；赤霉素响应元件 GARE-motif；缺氧特异性诱导响应元件GC-motif；参与防御和应激反应响应元件TC-rich-repeats等（表2）。另外，还有多种其他调控位点，比如调控转录水平的5′UTR Py-rich stretch，MYBHv1 结合位点 CCAAT-box，胚乳表达所需skn-1 motif元件，玉米醇溶蛋白代谢调控响应元件O2-site，参与分生组织表达响应元件CAT-box等。该预测结果说明PT2基因参与多种环境响应及代谢调节，是重要的调节因子。另外，对谷子和狗尾草PT2基因的启动子序列进行对比发现，二者只有8个核苷酸位点有差异（图2）。其中，只有2个位点分别位于2个G-box元件中。该结果暗示在2种植物中，PT2基因的调控基本一致。

表2 PT2启动子元件分析

2.3 谷子PT2家族基因表达部位分析

提取豫谷1号苗和穗的总RNA，并将其反转录为cDNA。以cDNA为模板，使用引物579F和1179R，检测该基因在不同部位的转录情况，结果表明，该基因在豫谷1号苗、穗部位均有表达（图3）。说明PT2基因可能参与多种代谢调节和环境响应。

2.4 PT2基因保守性分析

为分析PT2基因在不同品系中的保守性，将43种谷子和3种狗尾草的PT2基因前3个外显子（包括OsmiR396结合位点、WRC和QLQ的编码区域）进行了序列测定。

序列比对发现，其核酸序列高度保守，共发现4处SNP（图4），但是只有一处导致氨基酸突变（T190A）。该突变位点（T190A）在谷子和狗尾草中均被检测到，说明其与谷子和狗尾草之间籽粒性状、落粒性的差异无关。

3 讨论

对于水稻、小麦、谷子等禾本科作物而言，其籽粒大小、形状、数量以及落粒等性状是决定其产量高低的重要因素。研究表明，水稻PT2基因编码的Os GRF4蛋白能够调控籽粒形状、大小以及落粒性等多种性状。为研究该基因在谷子籽粒性状调控中的作用，本试验通过生物信息学的方法，确定了谷子和狗尾草中的PT2候选基因。通过对谷子PT2基因启动子中各种相应元件的分析发现，该基因的启动子含有多种环境（如光照、干旱）和激素（如水杨酸、茉莉酸）等响应元件，暗示其参与多种代谢调节。RNA转录检测结果也显示，其在植株不同部位均有表达，进一步确定该基因具有多重功能。但是，本研究并未发现该基因其他形式的转录本。

值得注意的是，谷子与狗尾草的PT2基因编码蛋白序列完全一致，仅在个别品系中发现一个氨基酸的点突变。该点突变在谷子和狗尾草中均存在。该基因启动子序列也基本吻合，仅存在几个核苷酸的差异。其中，2个差异分别位于2个G-box元件中。这2个差异是否影响该基因对某些因素的响应，尚未确定。然而，谷子和狗尾草籽粒性状差异显著，比如籽粒形状明显不同，落粒性完全相反。说明在2种植物体内，其他未知的基因调控了上述差异，其与水稻不同。

本研究通过生物信息学的方法确定了谷子和狗尾草的PT2基因，并且通过二者间的比对，初步判断PT2基因与谷子籽粒大小、形状以及落粒性等性状无关，结果为后续筛选相关基因奠定了坚实的基础。

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