铁皮石斛高效快速繁殖体系研究

卢 莉 ，刘晓芳 ，Saad Abdel r ahman ，王景雪

（1.山西大学生命科学学院，山西 太原 030006；2.新英格兰大学环境与农业学院，澳大利亚 阿米代尔 2350）

铁皮石斛为我国古老的中药材，在《神农本草经》、《本草纲目》、《中药大词典》等书籍中都有记载，以茎入药，具有益胃生津、延年益寿、滋阴、明目等功效，被国际药用植物界称为“药界大熊猫”[1]。铁皮石斛植株内有许多生物活性成分，大分子包括凝集素、细胞分裂素氧化酶、生物碱和多糖，其中，石斛多糖有免疫调节的作用[2]。生物碱有抗氧化、抗癌和神经保护的作用；其他化合物也具有抗氧化、抗癌和免疫调节的作用[3-4]。随着现代科技的进步，铁皮石斛被越来越多的学者所研究，研究其中的有效成分及其发挥药性的基因。市场上的相关产品多种多样，有干制品“铁皮枫斗”，有新鲜的石斛茎条，也有铁皮石斛和其他中药按一定比例制成的保健品。铁皮石斛自然繁殖率较低，而且由于生活环境缺失、农业的过度开发、城市化、过度采集以及医药的使用等原因[5-6]，导致野生铁皮石斛每年的产量非常少。目前，野生铁皮石斛资源接近濒危，组培苗移栽田间往往存在成活率低的问题。另外，移栽苗对栽培环境和管理技术要求较高，栽培基质对铁皮石斛移栽的成活率和生长繁殖影响很大[7]，而且要求在田间生长的时间较长，因此，利用悬浮培养方法培养铁皮石斛原球茎，可为铁皮石斛产品提供新的原材料[8]。

常规的铁皮石斛组织培养体系是采用固体培养的方式进行培养，该培养方式具有简便、容易操作、不易污染等优点；但是也存在生长较慢、培养设施占地空间较大等弊端。而石斛原球茎悬浮培养具有生长周期短、效率高、成本低等优点，是解决石斛增殖效率低的有效途径之一，也是近几年研究的热点[9]。史俊等[10]选用15种液体培养液对铁皮石斛种子悬浮培养最适培养基进行了筛选，得到的最佳悬浮培养基为：1/2 MS＋0.5 mg/L NAA＋80 g/L土豆汁＋45 g/L蔗糖。研究发现，相对较低的无机盐浓度对种子的萌发有较显著的影响，低浓度的NAA，不添加6-BA有利于原球茎的形成，不添加激素也可以诱导出原球茎。贾炜珑等[11]探讨康乃馨、菊花快速繁殖的培养基激素组成时发现，低浓度的6-BA和适当浓度的NAA可以有效促进幼苗分化且移栽成活率较高。

本试验旨在研究一种结合悬浮培养和固体培养2种方式优化铁皮石斛快速繁殖的技术，以缩短铁皮石斛种子诱导原球茎到再生植株成苗的组织培养周期，为铁皮石斛种苗工业化生产提供理论和技术参考。

1 材料和方法

1.1 材料

试验所用种子是山西大学生命科学学院植物学实验室铁皮石斛人工授粉所得。

1.2 方法

固体培养条件：接种后的培养基放置在组培室内，温度25℃左右，光照强度1 500 lx，光照时间为12 h/d。

悬浮培养条件：接种后的培养基放在摇床内，转速110 r/min，温度25℃左右，光照强度1 500 lx，光照时间为12 h/d。

1.2.1 铁皮石斛种子萌发 取人工授粉后、成熟保持新鲜且尚未开裂的蒴果（图1-A），先冲洗干净，再用75%的酒精、0.1%HgCl2消毒，然后用无菌水冲洗，无菌滤纸吸干水分[12]，接种于MS培养基上。将接种好的种子置于植物组培室进行无菌培养。

1.2.2 铁皮石斛原球茎悬浮培养 以30 g/L蔗糖为基础，采用正交设计方案，确定了4个试验因素：基本培养基、（NH4）2SO4与 KNO3的质量比、细胞分裂素6-BA、生长素NAA，基本培养基为花宝一号[13]、N6和1/2 MS共3个水平，（NH4）2SO4与KNO3的质量比分别设0.33 g/L∶0.525 g/L，0.99 g/L∶1.515 g/L，1.65 g/L∶0.505 g/L共3个水平，细胞分裂素6-BA为0.1，0.3，0.5 mg/L共3个水平，生长素NAA为0.4，0.6，0.8 mg/L共3个水平，采用L9（43）正交表，进行4因素3水平正交试验，共9个处理。称取0.1g原球茎接种于30mL液体培养基中，培养30d，每个处理接种5瓶，重复3次，每处理共15瓶。接种后的培养基放入摇床内，30 d后统计原球茎的鲜质量和长势。

1.2.3 铁皮石斛原球茎分化 以25g/L蔗糖＋6.5g/L琼脂＋1 g/L活性炭为基础，采用正交设计方案，确定了4个试验因素：基本培养基、细胞分裂素6-BA、生长素NAA、土豆汁，基本培养基为1/2 MS，N6，Kc共3个水平，细胞分裂素6-BA为0.1，0.2，0.3 mg/L共3个水平，生长素NAA为0.2，0.4，0.6 mg/L共3个水平，土豆汁为50，75，100 g/L共3个水平，采用L9（43）正交表，进行4因素3水平正交试验，共16个处理。取悬浮培养30 d后的原球茎，用镊子将其轻轻移入固体培养基中，每瓶移入6个，每个处理接种6瓶，重复3次，每处理共18瓶。接种后的培养基标号放入组培室内，60 d后统计原球茎的鲜质量。

1.3 数据处理

统计结果在Excel上处理计算，先用Graphpad prism软件进行方差分析，然后进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 铁皮石斛种子萌发

按1.2.1所述方法，用铁皮石斛的种子诱导原球茎。铁皮石斛种子接种于不添加任何植物激素的培养基里萌发，结果发现，15 d后种子膨大、发绿，30 d后测其直径为0.473～0.523 mm（图1-B）。

2.2 铁皮石斛原球茎悬浮培养

将铁皮石斛种子固体培养30 d后所得的原球茎接种于液体培养基中增殖，研究基本培养基、细胞分裂素6-BA、生长素NAA和（NH4）2SO4与KNO3的质量比对原球茎增殖的影响（表1，2）。铁皮石斛原球茎在液体培养基中培养30 d后的生长情况如图1-C所示，原球茎分化程度高，增殖效率高，但颜色有些发白。由表1可知，（NH4）2SO4与KNO3的质量比为0.33 g/L∶0.525 g/L时在悬浮培养原球茎试验中占主要位置，4个因素对原球茎增殖率的影响大小顺序为：（NH4）2SO4∶KNO3＞基本培养基＞细胞分裂素6-BA＞生长素NAA。采用方差分析进一步验证得出（表 2），（NH4）2SO4与 KNO3质量比的 F值最大，达到极显著水平，说明（NH4）2SO4与KNO3的质量比在原球茎增殖中影响最大；基本培养基也达到极显著水平，影响力次之。

表1 铁皮石斛原球茎悬浮培养正交试验结果

表2 铁皮石斛原球茎悬浮培养方差分析结果

2.3 铁皮石斛原球茎分化

将液体培养30 d后的原球茎接种到固体培养基上，研究基本培养基、细胞分裂素6-BA、生长素NAA、土豆对原球茎分化的影响。培养60 d后统计原球茎的鲜质量，其结果如表3所示。

铁皮石斛原球茎悬浮培养后在固体培养基上生长60 d，最优鲜质量为4.07 g，大部分幼苗有分化现象，长势良好（图1-D）。

从表3，4可以看出，试验中4个因素对幼苗鲜质量影响的主次顺序为：细胞分裂素6-BA＞基本培养基＞生长素NAA＞土豆，细胞分裂素6-BA和基本培养基都达到了极显著水平，在幼苗生长过程中影响很大；生长素NAA达到了显著水平，影响力次之；有机添加剂土豆对于幼苗生长的影响力较弱。

对试验中各因素各水平之间的平均数进行多重比较，以分析确定哪2个水平之间的差异显著，结果列于表5。

由表5可知，基本培养基中Kc培养基的原球茎鲜质量与N6培养基处理间有显著性差异；细胞分裂素6-BA浓度为0.1 mg/L的原球茎鲜质量与0.2，0.3 mg/L处理间有显著性差异；生长素NAA的浓度为0.6 mg/L的原球茎鲜质量与0.2 mg/L的处理间差异显著性达到0.05水平。

表3 铁皮石斛原球茎悬浮培养之后的固体培养正交试验结果

表4 铁皮石斛原球茎悬浮培养之后的固体培养方差分析试验结果

表5 各因素各水平之间平均数多重比较的结果

经研究，筛选出铁皮石斛不同生长阶段最佳繁 殖体系如表6所示。

表6 铁皮石斛原球茎最佳繁殖体系

3 讨论

徐玲等[14]用不同有机附加物组合对铁皮石斛原球茎鲜质量增质量进行研究，结果表明，在培养60 d后，原球茎鲜质量增质量最高的培养基是MS＋0.5 mg/L NAA＋1 mg/L 6-BA＋100 g/L土豆汁＋100 g/L小麦面粉＋20 g/L蔗糖＋6 g/L琼脂＋0.5 g/L活性炭，鲜质量是不添加有机附加物对照的5.35倍。本试验中原球茎增殖采用悬浮培养，优化出的最佳培养基为1/2 MS＋0.4 mg/LNAA＋0.1 mg/L 6-BA＋0.33 g/L（NH4）2SO4∶0.525 g/L KNO3＋30 g/L蔗糖，在培养30 d，原球茎鲜质量平均增殖率为6.73%。侯丕勇等[15]用不同激素对悬浮培养的铁皮石斛原球茎在固体培养基上生长和分化进行研究，结果得出，NAA对原球茎的分化作用较好，与本试验得出的结论生长素NAA对悬浮培养后原球茎增殖分化长成幼苗的影响中达到了显著水平的结果一致。

本研究结果表明，以种子为外植体，在固体培养基萌发、液体培养基增殖、再接种到固体培养基分化生根的体系，具有促进原球茎增殖、大大增加原球茎分化率、缩短组培时间、节省生产空间、节约成本、生根率较高（达90.1%）等特点，适合大规模推广。

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