温阳振衰颗粒对阿霉素致心肌细胞损伤MEF2表达的影响

蔡虎志，王笑莹，陈青扬，陈新宇

(1. 湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007；2. 贵阳中医学院，贵州 贵阳 550000)

慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)是各种心脏疾病进展至严重阶段而引起的一种复杂的临床综合征，在心血管研究领域中，无论对于西医还是中医，其都是一种难以预防和治疗的疾病[1]。其发病率高，有临床症状的患者5年存活率与恶性肿瘤相仿[2]。据现有资料估测，该病总患病率为0.4%～2%，其中老年人患病率接近10%，该病一旦确诊，患者5年内生存率男性仅25%，女性仅38%[3]。胞外信号调节激酶5(extracellular signal-regulated kinase 5，ERK5)是丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)家族中的一种非典型通路，主要定位于胞质，接受细胞外传来的信号并由其上游激酶MEK5激活。课题组前期研究发现，ERK5磷酸化蛋白具有显著的心肌保护特点[4]，而其下游关键调控基因肌细胞增强因子2(Myocyte enhancer factor 2, MEF2)在慢性心力衰竭的病理过程中具有怎样的表达特点与规律，温阳振衰颗粒是否通过ERK5下游通路调控蛋白MEF2的表达从而产生治疗作用尚不清楚，故笔者设计并完成了本实验，现将结果报道如下。

1 实验资料

1.1H9C2心肌细胞株的传代培养 H9C2心肌细胞传代在含10% FBS的DMEM培养基中进行，当细胞长满培养瓶底壁时，加入含EDTA 0.25%胰蛋白酶至培养瓶中，同时使用吸管轻轻吹打将贴壁的细胞吹下，制成单细胞溶液，取少许剩余的细胞悬液稀释后计数，根据细胞计数调整细胞浓度至合适的比例，种板后继续培养，用于下一步的细胞实验。

1.2含药血清的制备 用蒸馏水将温阳振衰颗粒(由附子、干姜、甘草、红参等组成)1.44 g/(kg·d)配成6 mL溶液给大鼠灌胃[4]，每日2次，每次3 mL，连续灌胃7 d后腹主动脉取血。3 000 r/min离心，取上清，抽滤除菌后分装，置-20 ℃冰箱保存备用。

1.3心肌细胞损伤的诱导 向H9C2心肌细胞培养液中加入阿霉素(ADR)，将浓度配制为2.67 μmol/L，培养44 h[5]。

1.4分组 实验分别为正常对照组、H9C2损伤组、5%含药血清组和10%含药血清组，每6孔细胞为一组，将H9C2心肌细胞种于6孔板。H9C2损伤组的培养基中加入2.67 μmol/L的ADR，两含药血清组培养基中加入2.67 μmol/L的ADR和5%，10%的温阳振衰颗粒含药血清，共培养44 h。

1.5心肌细胞存活率检测 实验结束后，收集心肌细胞并调整细胞悬液浓度，以20 μL/mL的标准向各培养基中加入MTT溶液，吸取经MTT培养后各组细胞的上清液，再向其中加入DMSO溶解液，每孔加入150 μL，而后将培养板放置在摇床上进行振荡，速度需低，时间为10 min，以使每个培养孔内的结晶物质都得到充分溶解。最后在酶联免疫检测仪490 nm处测量培养板中各组细胞的吸光度。

1.6p-MEF2与MEF2表达检测 采用Western-blot检测，即将50 μg心肌细胞总蛋白加入2×SDS上样缓冲液，100 ℃变性8 min，上样，恒定电流，前15 min 16 mA/gel电泳，然后32 mA/gel电泳至底部。电转印按照膜面积0.8 mA/cm2设定电流，转膜2 h。分别加入一抗，4 ℃过夜。加入酶标二抗，室温杂交2 h。TBST漂洗10 min×3次。ECL曝光显像，扫描，保存，分析。

2 结 果

2.1各组H9C2心肌细胞存活率比较 正常对照组心肌细胞存活率为(91.85±5.52)%，H9C2损伤组为(31.63±4.72)%，5%含药血清组为(47.52±4.64)%，10%含药血清组为(58.94±4.13)%。各损伤组细胞存活率均明显低于正常对照组(P均<0.05)，5%含药血清组和10%含药血清组均明显高于H9C2损伤组(P<0.05)，且10%含药血清组明显高于5%含药血清组(P<0.05)。

2.2各组H9C2心肌细胞p-MEF2与MEF2表达情况 各损伤组H9C2心肌细胞p-MEF2表达量均明显低于正常对照组(P均<0.05)，5%含药血清组和10%含药血清组均明显高于H9C2损伤组(P均<0.05)，且10%含药血清组明显高于5%含药血清组(P均<0.05)。各组间H9C2心肌细胞MEF2表达量比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表1及图1。

表1 各组H9C2心肌细胞p-MEF2与MEF2的表达

注：①与正常对照组比较，P<0.05；②与H9C2损伤组比较，P<0.05；③与5%含药血清组比较，P<0.05。

图1 各组H9C2心肌细胞p-MEF2与MEF2表达情况

3 讨 论

MEF2属于MADS蛋白家族，在心肌中高表达[6]。已发现的脊椎动物 MEF2 亚型有MEF2A、MEF2B、MEF2C、MEF2D[7]，心肌中主要亚型为MEF2A和MEF2D[8]。MEF2与活性组蛋白乙酰基转移酶(HATs)正相关[9]，与组蛋白去乙酰化酶(HDACs)负相关。HDAC4或5上有1个MEF2停靠区域，Ca2+-CaM或伴侣蛋白14-3-3结合至该区域可解除HDAC对MEF2的抑制作用，使MEF2释放并通过与其他因子的相互作用起始肥厚基因转录。MEF2基因失活可致心脏发育停止，ANP基因表达下调[10]，缺乏MEF2的小鼠表现出非正常的心脏功能，但可抵抗压力诱导的心脏重塑(如心肌肥厚)[11]。MEF2A或者MEF2C相关的肥厚心肌细胞形态学变化并不随钙调磷蛋白磷酸酶的活化而进一步变化，表明MEF2因子诱发心肌细胞肥大的过程相对独立，不受钙调磷蛋白磷酸酶的调节[12]。MEF2首先调节某些心肌细胞特异性基因的表达，进而影响细胞核的转位、细胞骨架的重塑和线粒体网状结构的完整性，并最终造成心力衰竭过程中常见的心脏管腔扩张、增生和心肌收缩功能失调[13]。MEF2活性可受ERK5调节，ERK5结合于MEF2的MADS结构域，能够磷酸化MEF2A、MEF2C和MEF2D的顺式激活结构域而提高转录活性。ERK5对MEF2C顺式激活结构域的磷酸化作用是通过对c-jun表达的刺激作用而调控细胞周期进程。此外，ERK5含有一个转录激活结构域，这表明ERK5作为辅激活因子募集基本转录器而激活MEF2依赖的转录[14]。这两个机制都适用于ERK5对MEF2活性的调节。

温阳振衰颗粒是由本课题组研发的湖南中医药大学第一附属医院院内制剂，其基本组方在医院门诊及住院部已经安全、有效地使用了8年余。其组方中附子温肾阳，干姜补脾阳，二者一走一守，扶阳破阴，逐寒救逆[15]。炙甘草调和补虚，被广泛应用于急慢性心功能不全、冠心病、心律不齐等，也用于温阳化气，治疗心源性或肾源性水肿[16]。在四逆汤基础上加红参可温阳补气、复脉固脱，如虞抟说附子“能引人参……以追复其失散之元阳……”[17]，不仅有回阳救逆之效，又增温经通络之能。本课题组前期研究已发现，温阳振衰颗粒在有效改善慢性心力衰竭实验动物症状的同时可以显著上调心肌ERK5蛋白磷酸化的表达[4]。本实验结果发现，温阳振衰颗粒可以调控ERK5蛋白的关键下游靶基因MEF2蛋白磷酸化的表达，这可能是其治疗慢性心力衰竭的重要机制之一，但具体调控模式尚需进一步研究。

[参考文献]

[1] 中华医学会. 临床诊疗指南·心血管分册[M]. 北京：人民卫生出版社，2010

[2] 陈灏珠，林果为. 实用内科学[M]. 北京:人民卫生出版社，2012:1366

[3] Hunt SA. ACC/AHA 2005 guideline update for the diagnosis and management of chronic heart failure in the adult:a report of the American College Cardiology/America Heart Association task force on practice guidelines[J]. Circulation,2005,112(12):154-235

[4] Chen X,Cai H,Chen Q,et al. Effects of Wenyangzhenshuai Granule on ERK1/2 and ERK5 activity in the myocardial tissue in a rabbit model of adriamycin-induced chronic heart failure[J]. Int J Clin Exp Med,2015,8(11):20732-20741

[5] 何玲,孙桂波,孙潇,等. 木犀草苷对阿霉素诱导乳鼠心肌细胞损伤的保护作用[J]. 中国药理学通报,2012,28(9):1229-1233

[6] 殷培培,吴剑,龚惠,等. 钙离子钙调蛋白激酶Ⅱ-组蛋白去乙酰化酶信号通路与心肌肥厚的研究进展[J]. 上海医学，2013，36 (11):976-979

[7] Black BL,Olson EN. Transcriptional control of muscle development by myocyte enhancer factor-2 (MEF2) proteins[J]. Annu Rev Oell Dev Biol,1998,14(2):167-196

[8] Fickett JW. Quantitative discrimination of MEF2 sites[J]. Mol Cell Biol,1996,16(1):437-441

[9] 王维亭,赵专友,汤立达. 心衰治疗靶点与干预研究进展[J]. 中国新药杂志，2010，19(6):486-493

[10] Zarain-Heizberg A，Fragoso-Medina J,Estrada-Avilés R. Calcium-regulated transcriptional pathways in the normal and pathologic heart[J]. IUBMB Life,2011,63(10):847-855

[11] Kim Y,Phan D,van Rooij E,et al. The MEF2D transcription factor mediates stress-dependent cardiac remodeling in mice[J]. J Clin Invest,2008,118(1):124-132

[12] Xu J,Gong NL,Bodi I,et al. Myocyte enhancer factors 2A and 2C induce dilated cardiomyopathy in transgenic mice[J]. Biol Chem,2006,281(14):9152-9162

[13] Van Oort RJ,Van Rooij E, Bourajjaj M,et al. MEF2 activates agenetic program promoting chamber dilation and contractile dysfunction in calcineurin-induced heart failure[J]. Circulation,2006,114(4):298-308

[14] Cude K,Wang YP,Choi HJ,et al. Regulation of the G2-M cell cycle progression by the ERK5-NFkB signaling pathway[J]. J Cell Bio,2007,177(2):253-264

[15] 张智琳,洪永敦. 浅析四逆汤类方治疗心力衰竭的特点[J]. 中华中医药杂志，2005,20(4):225-227

[16] 雷国奇. 四逆汤类方证治规律及临床应用研究[D]. 武汉：湖北中医药大学,2010

[17] 邢斌. 附子功效主治发微(下)[N]. 中国中医药报,2006-09-11006