应用MSP检测子宫内膜异位症相关性卵巢癌中RASSF2A基因启动子甲基化状态

严力锋，汪期明

子宫内膜异位症最常异位于卵巢，是最常见的妇科良性疾病之一；但表现出多种恶性行为，并可发生恶变。卵巢子宫内膜异位症恶变的主要细胞学类型是子宫内膜样腺癌和卵巢透明细胞癌，称为子宫内膜异位症相关性卵巢癌（EAOC）。RASSF2A基因是抑癌基因的一种，该基因的失活同胃癌、肺癌、鼻咽癌及卵巢癌等肿瘤的发生密切相关[1-4]。

MSP法检测甲基化的原理是根据甲基化和非甲基化等位基因修饰后的序列不同，设计两对分别针对甲基化和非甲基化状态的引物，通过PCR扩增产物的不同，反映特定区域的甲基化状态。本研究通过MSP法分析RASSF2A基因启动子区甲基化状态与EAOC的研究作用，现将结果报道如下。

1　资料与方法

1.1一般资料 收集2015年5月至2016年5月宁波市妇女儿童医院因卵巢癌行手术治疗患者的石蜡包埋标本。患者年龄22～69岁，平均40岁。病例组：30例卵巢透明细胞癌（OCC）患者的组织，30例卵巢子宫内膜样腺癌（OEA）患者的组织。对照组：正常子宫内膜组织。剔除标准包括：原发性癌，新辅助化疗患者，缺乏石蜡标本。所有病例在手术前6个月内没有接受GnRH-a或者性激素治疗或使用抗生素。

1.2研究方法

1.2.1标本采集方法 收集各病理组织后进行常规处理，切下后放置到冰盒当中，冰箱保存，提取DNA完成甲基化研究。

1.2.2DNA提取方法 使用DNA提取试剂盒（天根生化科技有限公司TIANGEN DP215）提取DNA：（1）将重量组织处理为匀浆，转移至EP管中，10000 r/m in，离心1 min。离心结束后，加入缓冲液GB（200l）、蛋白酶K溶液（20l），颠倒摇匀，56℃放置水浴，隔半个小时颠倒摇匀1次，孵育3～4 h，直至组织完全消化。（2）将上述EP管取出，加入－20℃的无水乙醇（200l），颠倒摇匀，可见EP管中少许絮状物。（3）将EP管中液体置入吸附柱CB3，放入收集管，离心30 s，转速设置为12 000 r/m in，离心结束后，取出收集管，弃管中废液，吸附柱CB3置入收集管。（4）将缓冲液GD（500l）放入吸附柱CB3，设置转速为12 000 r/min，离心30 s，离心结束后，弃废液，吸附柱CB3放入收集管。（5）漂洗液PW（700l）置入吸附柱CB3，开始离心，调整转速为12 000 r/min，时间30 s，离心结束后，弃废液，将吸附柱CB3放入收集管中。（6）漂洗液PW（500l）置入吸附柱CB3，开始离心，设置转速12 000 r/m in，时间30 s，离心结束后，弃废液。（7）继续离心，设置转速12000 r/m in，时间 2m in，离心结束后，弃废液。（8）为清净参与漂洗液，在室温下将吸附柱CB3静置4～6 min，使漂洗液自然风干（因漂洗液中添加过乙醇，而乙醇会影响后续试验结果，所以需室温下静置，风干残留乙醇及漂洗液）。（9）吸附柱CB3换1.5m lEP管，置入洗脱缓冲液TB（150～200l），室温下静置 4 ～ 5 min（此步需剪去吸附柱的盖子，EP管上写两个编号；且置入洗脱缓冲液TB时，需悬空滴入，吸附膜中间处最佳）。（10）继续离心，设置转速12000 r/min，时间2min，离心结束后，离心管中液体即为溶解的DNA。（11）将DNA溶液保存在―20℃冰箱中备用。

1.2.3DNA的SssI修饰和纯化 （1）稀释S-腺苷甲硫氨酸（SAM）：取1l的32 mmol/L浓度的SAM，加入19l去离子水，使终浓度为160mol/L。（2）依次加入以下组分：10×NEBBuffer2l，SAM（160mol/L）2l，DNA 1g，M.ssI(4 U/l)1l，去离子水15l，总体积20l。（3）轻轻混匀，37℃孵育 1 h，65 ℃热失活20 m in终止反应。

1.2.6修饰后DNA纯化回收 （1）按照Promega Wizard Cleanup DNA纯化回收说明，70℃水浴预热双蒸水；配置80%异丙醇。（2）加1m lPromega’s Wizard DNA Clean-up resin，轻柔颠倒混匀，使DNA充分与树脂结合。（3）将混合物移入注射器针筒，缓慢移动针栓，排出液体，小柱内有回收的白色树脂。（4）将80%的异丙醇2m l移入针筒内（针筒与回收小柱相连）。缓慢移动针栓排出液体，洗脱小柱内已回收的白色树脂。（5）将回收小柱放入新管内，12 000 r/min离心2 m in，去除残余液体，甩干树脂。（6）加入70℃水浴预热的双蒸水50l，5m in后，12000 r/m in离心 20 s。（7）移液器加3M NaOH 5.5l，作用15m in，－20℃保存备用。

1.2.7甲基化特异性PCR （1）引物序列：甲基化特异 性 引 物 MSP-forward 5’-GTTCGTCGTCGTTTTTTAGGCG-3’和 MSP-reverse 5’-AAAAACCAACGACCCCCGCG-3’，非甲基特异性引物为USP- forward，USP- forward 5’-AGTTTGTTGTTGTTTTTTAGGTGG-3’和 USP-reverse 5’-AAAAAACCAACAACCCCCACA-3’，扩增片段均为 108 bp。（2）应体体系：10×PCR Buffer 2l，dNTPmix(2.5 mmol/L dNTP)1.6l，上游引物（10mol/L）0.4l，下游引物（10mol/L）0.4l，修饰后的DNA 2l，热启动酶＆DNA聚合酶0.1l，去离子水13.5l，总体积 20l。（3）反应条件：95℃预变性5 min，94℃变性30 s，甲基化特异性引物58℃退火30 s，非甲基化特异性引物54℃30 s，然后72℃延伸30 s，共35个循环，最后72℃延伸6 min反应完成。（4）2%琼脂糖凝胶电泳PCR产物。（5）甲基化判断标准：同一标本，如果非甲基化引物和甲基化引物均有产物扩出，或仅甲基化引物有产物扩出，判断为甲基化；如果仅有非甲基化引物有产物扩出，而无甲基化引物产物扩出，判断为非甲基化。

1.3统计方法 采用SPSS 13.0软件进行统计学分析，两组计数资料比较采用2检验。＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

本研究采用针对RASSF2A启动子MSP特异性引物对启动子区甲基化状态进行检测，结果发现卵巢透明细胞癌组织RASSF2A基因启动子甲基化阳性率明显高于正常子宫内膜组织（2=27.8，＜0.05），卵巢子宫内膜样腺癌组织RASSF2A基因启动子甲基化阳性率明显高于正常子宫内膜组织（2=34.7＜0.05），见表1。部分组织的MSP结果见封二彩图4。

3　讨论

子宫内膜异位症发生率在育龄期女性是7%～15%，绝经后女性少于2%[5]。虽然子宫内膜异位症是一种良性疾病，但表现出多种恶性行为，包括局部和远处转移，与邻近组织粘连，然后侵袭和破坏。目前子宫内膜样腺癌和透明细胞癌是EAOC主要的组织病理学亚型[6]，而且其他恶性肿瘤的病理组织学亚型也与子宫内膜异位症相关，已知的有交界性浆液性癌或浆液性癌，但发生率很少[7]。

子宫内膜异位症恶性转变为肿瘤的过程中存在许多基因学事件，如染色体杂合性缺失（LOH）和基因突变等，如LINE-1、ARID1A和BAF250a、PIK3CA等的突变[8-10]。近些年随着对肿瘤发生的分子生物学机制研究的不断深入，表观遗传学在肿瘤发生中的作用逐渐受到人们的重视。它的主要表现形式有：DNA甲基化、组蛋白修饰、基因组印记、母体效应及RNA编辑等。DNA甲基化是重要的表观遗传学修饰形式，研究表明抑癌基因启动子区CpG岛的高甲基化是导致抑癌基因失活的一个重要机制[11]。

表1　不同组织中RASSF2A基因启动子甲基化率的比较

RAS蛋白通过一些重要的信号传导途径调节细胞的分化、增殖及凋亡等生命活动。研究表明：RAS信号通路的改变可导致肿瘤的发生，近年来一组含有RAS相关结构域的蛋白被命名为RASSF家族，是 RAS激活信号传导通路中非常重要的负效应调节子。迄今为止，共发现10种RAS相关结构域家族成员，其中有9种在人类肿瘤中低表达或缺失[12]。RASSF2A基因作为一个潜在的抑癌基因，其表达减弱或缺失已见于结肠癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、梅克尔细胞癌及尤文氏肉瘤等肿瘤。但目前有关 RASSF2A基因表达及其启动子区甲基化状态与子宫内膜异位恶变关系的研究尚未见报道。

本实验采用 MSP方法测定各个组织的 RASSF2A启动子甲基化情况，MSP法检测甲基化的原理是根据甲基化和非甲基化等位基因修饰后的序列不同，设计两对分布针对甲基化和非甲基化状态的引物，通过PCR扩增产物的不同，反映特定区域的甲基化状态。MSP法特异性高、简单易行、费用和耗时小。在本研究中，30例卵巢透明细胞癌和30例卵巢子宫内膜样腺癌，分别有63.33%和73.33%的患者发生RASSF2A启动子甲基化，而正常的子宫内膜组织中没有发生甲基化，差异有统计学意义（＜ 0.05）。

DNA甲基化是复制 DNA之后重要的调节方式，与胚胎发育及细胞分化相关。有研究认为基因启动子的甲基化在抑癌基因失活过程中的影响很大，RASSF2A失活的主要途径是启动子区的甲基化[13-14]。RASSF2A甲基化之后丧失负向调节细胞的作用，导致细胞容易出现恶变。有文献报道，在结肠癌细胞系中存在70%～89%的RASSF2A启动子甲基化，结肠癌中有42.0%～72.6%的RASSF2A启动子甲基化[15-16]。

综上所述，RASSF2A启动子甲基化跟EAOC的发生相关。随着对该领域研究的深入尤其是抑癌作用的明确，RASSF2A启动子甲基化可以作为早期诊断EAOC的重要生物学方法。

参考文献：