黄新伟,郑建华,陈文滨,程金生
(1.惠州市第一人民医院药学部,广东 惠州 516003; 2.嘉应学院医学院客家养生保健研究,广东 梅州 514031)
中药半枝莲(ScutellariabarbataD. Don)为唇形科植物半枝莲的干燥全草,具有清热解毒、化瘀利尿的功效[1]。临床上多用于治疗虫蛇咬伤、疮肿肿毒、传染性肝炎、肝硬化腹水、肾炎水肿及跌打损伤等[2]。同时,现代药理研究结果证明,半枝莲具有良好的抗肿瘤活性,常配伍其他中药治疗鼻咽癌、肝癌、胃癌、直肠癌、食道癌及肺癌等恶性肿瘤[3]。半枝莲含有多种化学成分,如黄酮类化合物、二萜类化合物、甾体生物碱和多糖等,其主要生理活性物质为黄酮类和二萜类化合物[4]。近年来,大部分学者对半枝莲的多糖、黄酮类成分及提取物进行了抗肿瘤相关研究,或重点考察了中药成分的配伍和性味归经;在汤剂的药效研究中主要考虑药材中有效成分的溶出、煎煮过程中活性成分的复合作用和药性的变化[5-7]。但迄今尚无研究关注汤剂中存在着的大量粒径分布,即从纳米尺度一直延伸至微米范围的不溶固态微粒,更未考虑这些微粒对于汤剂药效所起的作用和贡献。本研究通过比较半枝莲汤剂和去除纳米颗粒的汤剂对肝癌细胞的体内外抑制作用,考察药效与汤剂纳米颗粒的关系,为破解汤剂中内在的纳米科技原理、中药现代化研究和中药制剂的开发奠定基础。
半枝莲饮片(惠州泛生中药饮片有限公司,批号:20161202);1640培养液、标准胎牛血清(Hyclone,赛默飞世尔生物制品北京有限公司,批号:Lot.No.20151201);噻唑蓝(MTT,美国Sigma公司,批号:M2319);二甲亚砜(DMSO,国药集团化学试剂有限公司,批号:T20151203);胰蛋白酶(美国Gibico公司,批号:3840006);半枝莲水提液(SEB,0.5 g/ml),实验室自制;去纳米颗粒的半枝莲水提液(SEB-RN),实验室自制;注射用环磷酰胺(CTX,山西普德药业股份有限公司,规格:0.2 g/瓶,批准文号:国药准字H14023686,批号:201609070)。
酶联免疫分析仪(瑞士TeCan公司);96孔培养板(丹麦Nune公司);SW-CJ-VS1超净工作台(无锡易纯净化设备有限公司);YP50001型电子天平(上海越平科学仪器有限公司);Thermo Scientific酶标仪(RT-2100C,深圳雷杜电子有限公司);UV-2202PCS紫外可见分光光度计(上海菁华科技仪器有限公司);十万分之一分析天平(天津市华仪盛达实验仪器有限公司);BC-J160S型CO2培养箱(上海博迅医疗生物仪器股份有限公司);XD-202倒置生物显微镜(南京江南永新光学有限公司)。
SPF级昆明种小鼠7周龄,雌雄各半,体质量18~21 g,由嘉应学院医学动物实验中心院提供;试验期间饲以该中心提供的饲料,自由饮水;饲养环境:温度18~22 ℃,湿度50%~60%(动物合格证号:51007)。实验瘤株:腹水型肝癌H22细胞株,由嘉应学院医学院实验动物中心提供并保存;人肝癌SMMC-7721细胞株,由嘉应学院医学院病理实验室提供并传代保种。
2.1.1 SEB:半枝莲药材500 g,粉碎后于提取罐中加水提取,提取温度为90~100 ℃,提取2次,第1次加入10倍体积的蒸馏水,第2次加入8倍体积蒸馏水,每次提取2 h,将提取液过滤后浓缩至含生药1 g/ml的溶液。用0.22 μm微孔滤膜过滤除菌,置于4 ℃冰箱保存,待用[8-9]。
2.1.2 SEB-RN:取“2.1.1”项下方法制得的SEB,以3 000 r/min离心20 min,取上层清液继续以5 000 r/min离心,取上层清液用超滤膜过滤制得。
2.2.1 人源肝癌细胞培养:将人肝癌细胞SMMC-7721接种于含10%胎牛血清的DMEM培养液中,置于37 ℃、体积分数为5%CO2饱和湿度的条件下培养,用5 g/L胰蛋白酶消化传代[10]。
2.2.2 MTT法测细胞增殖抑制率:取处于对数生长期SMMC-772细胞,用胰蛋白酶消化后,用含10%小牛血清的培养基配成浓度为5×104个/ml的细胞悬液,接种于96孔培养板上,每孔200 μl。在37 ℃、5%CO2的环境中培养24 h后,分别加入SEB、SEB-RN和CTX,使药物质量浓度为5×105、5×105和50 μg/ml,各20 μl,为实验组。模型组加入等体积的DMEM培养液作为对照。每组设4个平行孔,置于37 ℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养;在24 h取出培养板,每孔加入2 mg/ml的MTT溶液200 μl,在37 ℃条件下继续孵育4 h,离心,小心弃去上清液,并每孔加入200 μl的DMSO溶液,溶解沉淀颗粒,用振荡器震荡15 min混匀后,采用酶标仪在490 nm处测定吸光度(OD),并计算抑制率。细胞抑制率=[(模型组OD值的平均值-实验组OD值的平均值)/模型组OD值的平均值]×100%。
2.3.1 建立H22荷瘤小鼠模型:无菌抽取传代第7日的H22腹水型昆明种小鼠的腹水,以无菌0.9%氯化钠溶液按1∶3稀释,制成肿瘤细胞悬液,经台盼蓝染色,镜检肿瘤细胞存活率>95%,调整细胞浓度为1×107/ml。于每只小鼠右前腋皮下注射0.2 ml细胞悬液(约2×106个细胞),制成荷瘤小鼠肝癌模型[10]。
2.3.2 动物分组及给药:取肝癌荷瘤小鼠60只,称质量,随机分为4组,每组15只。第1组为CTX组,腹腔注射CTX 20 mg/kg,1日1次,连续给药14 d,次日颈椎脱臼处死;第2组为模型组,每日灌胃给予0.9%氯化钠溶液0.4 ml,1日1次,连续14 d,次日颈椎脱臼处死;第3组为SEB组,每日灌胃给予SEB 5 g/kg,连续给药14 d,次日颈椎脱臼处死;第4组为SEB-RN组,每日灌胃给予SEB-RN 5 g/kg,连续给药14 d,次日颈椎脱臼处死[8];将四组小鼠处死后,剥离瘤块,用滤纸吸净其肿瘤组织的液体,精密称瘤质量,计算肿瘤抑制率。同时分离胸腺、脾脏组织,精密称质量,计算胸腺指数、脾脏指数。肿瘤抑制率(%)=(模型组平均瘤质量-实验组平均瘤质量)/模型组平均瘤质量×100%。脏器指数(mg/g)=脏器质量(mg)/体质量(g)。
与模型组相比,CTX、SEB和SEB-RN均对SMMC-7721细胞的增殖有显著抑制作用;与SEB-RN相比,SEB对SMMC-7721细胞的增殖抑制率明显更高,见表1。
表1 体外抑制作用比较Tab 1 Comparison of inhibitory effects in
四组小鼠成功接种肉瘤后,第5日起模型组即可肉眼观察到肉瘤,其余三组实体瘤生长并不明显;随着时间延长,模型组和CTX组小鼠逐渐出现运动减少、毛发枯燥及体质量下降等现象,而其他两组正常。与模型组相比,CTX组、SEB组和SEB-RN组小鼠实体瘤的生长均得到了显著抑制,表明SEB和SEB-RN均有一定的抗肿瘤作用;与SEB-RN组相比,SEB组小鼠肿瘤抑制率明显更高,见表2。与模型组相比,CTX组小鼠胸腺、脾脏指数明显更低,SEB组、SEB-RN组明显更高,差异均有极显著统计学意义(P<0.01),表明SEB和SEB-RN能提高机体免疫功能;SEB组小鼠胸腺、脾脏指数明显高于SEB-RN组,差异有统计学意义(P<0.05),见表2。
表2 体内抑制作用比较Tab 2 Comparison of inhibitory effects in
半枝莲是中医临床上治疗恶性肿瘤的常用中药,很多中医处方和成药中都含有该药。近代药理学研究结果表明,半枝莲具有抗肿瘤、抗病原、抑菌、解热及保肝等作用,在临床上应用多年,对肝癌、肺癌、胃癌、直肠癌及鼻咽癌等均有一定的疗效。无论是在抑制或杀伤肿瘤细胞方面,还是术后减轻放化疗不良反应、改善症状和体征及提高生活质量等方面,该药均发挥了重要的作用。《常用草药治疗手册》载有,该药“治食道癌、胃癌、子宫癌”。半枝莲具有资源丰富、价格低廉等优点。近年来,随着提取工艺的不断提高,半枝莲的成分也逐渐明确。黄酮类化合物是半枝莲的次生代谢产物,具有很强的清除自由基的能力,可降低血脂,抑制血小板凝聚、细胞凋亡,同时还有抗病毒、抗肿瘤及抗突变等活性[11]。二萜类化合物也是半枝莲的主要化学成分,文献报道,二萜类生物碱具有一定的细胞毒性,能有效抑制多种肿瘤细胞的生长[12]。多糖是半枝莲的另一类主要化学成分。杨姗姗[5]等采用Sevag法对半枝莲多糖进行分离纯化,并采用苯酚-硫酸法测定其含量,还发现半枝莲多糖在体内对S180肉瘤的生长有一定的抑制作用,能够增加免疫器官的质量。CTX作为临床广泛应用的抗肿瘤药,常作为抗肿瘤试验的阳性对照品,但其副作用较明显,包括胃肠道反应、骨髓和免疫功能抑制等,故很少直接用于抗肿瘤治疗[13-14]。
石锐[15]等将不同质量浓度的半枝莲提取物作用于细胞K562,采用MTT法检测其对K562细胞增殖情况的影响,采用酶联免疫吸附法检测K562细胞上清液中血管内皮生长因子(VEGF)的浓度,采用聚合酶链式反应法检测K562细胞中VEGF mRNA的表达水平,阐释了其作用机制可能与降低K562细胞VEGF的浓度和下调VEGF mRNA的表达有关。李洁[16]等建立了肝癌H22小鼠血道转移模型,探讨半枝莲对肝癌H22肿瘤细胞转移的作用,结果显示,半枝莲可增强小鼠的免疫功能,减轻化疗药对其免疫器官的损害,同时能够明显降低小鼠肺质量、肺转移灶数目及肺转移瘤生长指数,表明半枝莲对肝癌血道转移确实有一定的抑制作用。
目前对半枝莲抗肿瘤作用的研究较多,但很少有关于半枝莲中药汤剂中纳米颗粒与药理作用的研究。本研究通过建立人源肝癌细胞SMMC-7721模型和H22荷瘤小鼠动物模型,比较SEB和SEB-RN对肝癌细胞在体内外生长的抑制作用,重点观察了其对SMMC-7721细胞增殖的抑制作用、用药前后小鼠
体质量变化、肿瘤抑制率、胸腺指数及脾脏指数等指标,初步探讨SEB的抗肿瘤药效与汤剂纳米颗粒的依赖关系。结果表明,SEB和SEB-RN均具有良好体内外的抗肿瘤作用,体外抗肿瘤试验中,SEB对SMMC-7721细胞的增殖抑制率明显高于SEB-RN,差异有统计学意义(P<0.05);体内抗肿瘤试验中,SEB组小鼠的肿瘤抑制率、胸腺及脾脏指数明显高于SEB-RN组,差异均有统计学意义(P<0.05)。由此可推断,上述结果和中药药效与汤剂纳米颗粒的依赖关系有关,汤剂中的纳米颗粒可促进中药活性成分发挥药理作用,但还需进一步深入研究。
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