甘油—卵黄—柠檬酸盐冷冻保护剂中添加二十二碳六烯酸对人精子冷冻前后运动学参数的影响

马春杰 庄嘉明 邓顺美 唐运革 秦卫兵 王奇玲 张欣宗

[摘要]目的 研究甘油-卵黃-柠檬酸盐（GEYC）冷冻保护剂中添加不同摩尔浓度二十二碳六烯酸（DHA）对人精子冷冻前后运动学参数的影响，探索n-3多不饱和脂肪酸在人精子冷冻中的应用价值。方法 选取2016年3月～2017年4月广东省计划生育专科医院人类精子库的筛查期供精者的33例精液标本，以GEYC冷冻保护剂为基础，外源性DHA在精液-GEYC混合液中的终浓度分别为对照组0 mmol/L、DHA 1组0.317 mmol/L、DHA 2组0.634 mmol/L、DHA 3组1.268 mmol/L。采用SCA 5.2计算机辅助精子分析系统分别检测添加冷冻保护剂后以及冷冻复苏后0～8 h的精子运动学参数。结果 冷冻前精液加入各组保护剂后，仅DHA 3组的VCL和VAP显著低于对照组（P<0.05），其他各组间的各项运动学参数差异均无统计学意义（P>0.05）；冷冻复苏后0、4、5、6、8 h，仅见DHA 3组偶有运动学参数下降，与其他3组比较差异有统计学意义（P<0.05），冻后0～8 h大部分运动学参数各组间差异均无统计学意义（P>0.05）。结论 甘油-卵黄-柠檬酸盐冷冻保护剂中添加DHA未见冷冻前后人精子运动学参数的提高，适量添加DHA可能通过其他途径对冷冻精子产生影响，大量添加DHA可能对冷冻前后部分运动学参数有负面影响。

[关键词]n-3多不饱和脂肪酸；精液冷冻；精子运动学参数；二十二碳六烯酸

[中图分类号] R691.9 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2018）4（a）-0004-05

Influence of addition of different molar concentration of DHA into Glycerol-Egg Yolk-Citrate Cryopreservative Mediums on the kinematic parameters of human sperm before and after cryosurgery

MA Chun-jie1 ZHUANG Jia-ming1 DENG Shun-mei1 TANG Yun-ge2 QIN Wei-bing1，2 WANG Qi-ling1 ZHANG Xin-zong1

1.Department of Andriatrics，Guangdong Institute of Family Planning Science and Technology （Guangzhou Family Planning Specialty Hospital），Guangzhou 510600，China；2.Key Laboratory of Male Reproductive and Heredity，State Health and Family Planning Commission，Guangdong Institute of Family Planning Science and Technology，Guangzhou 510600，China

[Abstract]Objective To study the influence of addition of different molar concentration of docosahexaenoic acid （DHA） into Glycerol-Egg Yolk-Citrate （GEYC） cryopreservative mediums on the kinematic parameters of human sperm before and after cryosurgery so as to explore the application value of n-3 polyunsaturated fatty acids in cryosurgery of human sperm.Methods Altogether 33 cases of semen samples which came from semen donors during human sperm bank screening period in Guangzhou Family Planning Specialty Hospital from March 2016 to April 2017 were selected.Based on GEYC cryopreservative mediums，the concentration of exogenous DHA in mixed semen-GEYC liquor were 0 mmol/L in the control group，0.317 mmol/L in the DHA 1 group，0.634 mmol/L in the DHA 2 group and 1.268 mmol/L in the DHA 3 group.SCA 5.2 computer-assisted sperm analysis system was used to detect the sperm kinematics parameters 0-8 hours after addition of cryopreservation and frozen resuscitation.Results After addition of cryopreservation and frozen resuscitation，only curve line velocity （VCL） and average path velocity （VAP） of the DHA 3 group were significantly lower than those of the control group （P<0.05），there was no statistically significant difference in kinematic parameters between the other groups （P>0.05）.After frozen recovery at 0，4，5，6，8 hours，only kinematic parameters of the DHA 3 group decreased occasionally，with statistically significant difference in contrast with 3 groups.After cryosurgery at 0-8 hours，most of the kinematic parameters had no statistically significant difference between each group （P>0.05）.Conclusion Addition of DHA into GEYC cryo-preservative mediums do not increase the sperm kinematic parameters before and after cryosurgery.The proper addition of DHA may affect frozen semen through other ways.Addition of a large number of DHA may have a negative impact on the part of the kinematic parameters before and after cryosurgery.

[Key words]n-3 polyunsaturated fatty acids；Semen cryosurgery；Sperm kinematics parameters；Docosahexaenoic acid

精液的冷冻保存是精子库和辅助生殖技术实验室的一项重要工作。冷冻复温过程能够破坏人精子结构的完整性，从而影响精子功能。很多动物实验显示，饮食添加[1-6]和冷冻稀释液[7]中直接添加n-3多不饱和脂肪酸（n-3 polyunsaturated fatty acids，n-3 PUFA），尤其是添加二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）（n-3 PUFA的一种）可以提高哺乳动物新鲜和冷冻后精液质量。Vireque等[8]的研究显示，含有卵黄的人精子冷冻保护剂中添加富含n-6和n-3 PUFA的大豆卵磷脂可以使人精子有效抵御冷冻损伤。已知CASA所检测的运动学参数的结果与体内、体外受精率及受孕所需时间有显著相关性[9]。DHA是与精子功能相关的最主要的n-3 PUFA[10]，在男性生殖过程[11-12]和动物精子发生及受精过程中[13]发挥非常重要的作用。目前，有关人精子冷冻保护剂中单独添加DHA对人精子运动学参数的影响却鲜有报道。本文以世界卫生组织（World Health Organization，WHO）《人类精液检查与处理实验室手册》第5版[9]推荐使用的甘油-卵黄-柠檬酸盐（glycerol-egg yolk-citrate，GEYC）冷冻保护剂为基础人精子冷冻保护剂，添加不同摩尔浓度的DHA，检测加入含有不同摩尔浓度的冷冻保护剂后以及复苏后0～8 h的人精子运动学参数的改变，探索DHA型n-3 PUFA在人精子冷冻保存中的应用价值。

1资料与方法

1.1一般资料

选取我機构人类精子库2016年3月～2017年4月的33例筛查期供精者，年龄22～36岁，身体健康，无遗传性疾病家族史，体检未发现睾丸、附睾及输精管异常。禁欲2～7 d，用消毒皂洗手，消毒湿巾清洁阴茎和尿道外口，手淫法取精，精液射入1个干燥无菌的广口取精杯中，37℃水浴充分液化。

33例供精者精液标本以GEYC冷冻保护剂为基础，外源性DHA在精液-GEYC混合液中的终摩尔浓度分别为对照组0 mmol/L、DHA 1组0.317 mmol/L、DHA 2组0.634 mmol/L、DHA 3组1.268 mmol/L。对照组为精液+GEYC冷冻保护剂，不添加DHA；DHA 1、DHA 2、DHA 3组为DHA添加组，由精液+GEYC冷冻保护剂+DHA组成，添加的DHA在精液和冷冻保护剂混合物中的终浓度分别为DHA 1组0.317 mmol/L、DHA 2组0.634 mmol/L、DHA 3组1.268 mmol/L。

1.2试剂和仪器

1.2.1试剂 GEYC冷冻保护剂按照WHO《人类精液检查与处理实验室手册》第5版的方法进行制备和存储，pH值为7.0，细菌培养结果为无菌生长，无精子毒性；DHA和配制GEYC冷冻保护剂所需的葡萄糖、柠檬酸三钠二水、甘氨酸、甘油均购买自Sigma公司（Sigma，America）。

1.2.2仪器 Makler计数池（Sefi-Medical Instrument，Israel）；计算机辅助精子分析（computeraided sperm analysis，CASA）系统为SCA 5.2（MicropticInc，Spain）。

1.3方法

1.3.1 SCA 5.2系统分析精子运动学参数 各组精液加入到DHA含量不同的冷冻保护剂后，充分混匀并孵育5 min后，用移液器量取10 μl精液和冷冻保护剂的混合液，加入到Makler计数池，温度始终保持在37℃，于SCA 5.2系统检测200条以上活动精子，获得精子运动学参数，包括平均路径速度（average path velocity，VAP）、直线速度（straight-line velocity，VSL）、曲线速度（curvilinear velocity，VCL）、精子头侧摆幅度（amplitude of lateral head displacement，ALH）、鞭打频率（beat-cross frequency，BCF）、前向性（straightness，STR）、直线性（linearity，LIN）。

1.3.2精子冷冻与复温 各组精液与DHA含量不同的冷冻保护剂混匀并检测精子运动学参数后，置于液氮上方1 cm处熏蒸10 min，然后置于液氮中保存。冻存1周后，将精液标本从液氮中取出，室温放置1 min后置于37℃水浴6 min，之后按照上述方法分别检测复苏后0、1、2、3、4、5、6、7、8 h精子的运动学参数。

1.4统计学分析

采用SPSS 22.0统计软件包对数据进行处理，计量资料以均值±标准差（x±s）表示，数据比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA），以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1各组精液与DHA含量不同冷冻保护剂混匀后运动学参数的比较

各组精液加入到DHA含量不同的GEYC冷冻保护剂后充分混匀并孵育5 min后，DHA 1组的VAP与对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05）；DHA 3组的VCL和VAP与对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05）；其他各组间运动学参数比较，差异无统计学意义（P>0.05）（表1）。

2.2各组精液复苏后0～8 h运动学参数的比较

DHA 3组冷冻复苏后0 h和4 h的BCF、6 h的VCL、8 h的STR与对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05）；DHA 3组冷冻复苏后4 h的VAP、WOB、BCF和5 h的STR与DHA 1组比较，差异有统计学意义（P<0.05）；DHA 3组冷冻复苏后4 h的BCF和6 h的VCL与DHA 2组比较，差异有统计学意义（P<0.05）；冷冻复苏后其他各时段各组间各项运动学参数比较，差异均无统计学意义（P>0.05）（表2）。

3讨论

多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids，PUFA）主要包括n-3、n-6和n-9系列脂肪酸，但有重要生物学意义的是n-3和n-6 PUFA。目前，有关PUFA，尤其是n-3 PUFA能提高精子浓度和活力以及提高家畜繁殖能力的相关研究得到了国内外许多研究人员的青睐。现有研究显示[10]，DHA是与精子功能相关的最主要的n-3 PUFA，DHA可以促进动物精子的成熟；当DHA整合到精子细胞膜中时，精子质膜才能呈现良好的流动性；DHA还参与精子细胞膜中蛋白介导的细胞应答，影响脂质介导体的产生、细胞信号转导和基因的表达。Martinez-Soto等[14]的研究显示，精子细胞膜的PUFA主要是DHA，占PUFA总量的50%；精浆中的DHA含量占PUFA总量的25%；在复苏率>50%的精液标本中，精子细胞膜DHA的含量明显高于复苏率<50%的精液标本。Aurich等[15]的研究提示，马因为季节性摄入PUFA量不同，导致马精子的冷冻复苏率不同。

有研究显示，精子和精液中DHA含量可以作为衡量精子耐冻潜能和冻后精子授精潜能的一个指标，且精子细胞膜n-3 PUFA特别是DHA的含量与冷冻后精子运动学参数呈正相关[14]；Safarinejad等[16]的研究提示，少弱畸形精子症患者补充n-3 PUFA可以改善精液质量的报道，所以有必要探索在精液里直接添加DHA，提高精子和精浆局部DHA含量对人精子的冷冻复苏前后运动学参数的影响，从而进一步影响精子的受精潜能。本文结合目前国内人类精子库的现状，在人精子GEYC型冷冻保护液中添加不同比例DHA，研究其对人精子冷冻前后运动学参数的影响，拟探索n-3 PUFA在供精者精子冷冻中的应用前景。结果显示，终摩尔浓度分别为0.317 mmol/L（DHA 1组）、0.634 mmol/L（DHA 2组）、1.268 mmol/L（DHA 3组）的外源性DHA添加各组，无论是冷冻前还是冷冻后均未见人精子运动学参数提高。冷冻前精液加入各组保护剂后，仅摩尔浓度最高组（DHA 3组）的VCL和VAP显著低于对照组，其他各组间的各项运动学参数差异均无统计学意义；冷冻复苏后0、4、5、6、8 h，仅见DHA 3组偶有运动学参数下降，与其他3组比较差异有统计学意义，大部分时间各项运动学参数差异均无统计学意义。虽然有研究提示DHA在人精子功能完整性和冷冻过程中发挥重要作用，也与精子运动学参数息息相关；也有动物实验提示在冷冻保护液中添加DHA可以提高精液冷冻效果[7]，但是本研究显示在人精子GEYC型冷冻保护液中添加外源性DHA并不能显著提高冷冻前后的人精子运动学参数。本文的研究结果与人口服DHA后精液参数变化相似[17]，试验组人员日服1500 mg富含DHA的油剂10周后，精液参数和精子膜脂肪酸组成未见改变，但是精液的抗氧化水平升高，DNA碎片率降低。DHA对人精子的影响可能不表现在改善精液常规参数，而是表现在降低DNA碎片率等遗传物质抗氧化方面。最近也有研究人员报道了类似的动物实验结果，膳食添加n-3 PUFA（来源于微藻类）使牛精子VPA、VCL、VSL、ALH等运动学参数显著降低，游动距离变短，能量代谢受损[18]，但是膜流动性显著增加可能在精子冷冻中发挥作用；不论是膳食单独添加PUFA还是PUFA和维生素E联合添加，牛持续摄入60 d后，均对冻融后精子的动力学参数有负面影响[19]；饮食摄入n-3和n-6 PUFA对奶牛和公羊新鲜精液的精液量以及冷冻前后的精子浓度和直线性运动精子数无影响，精子膜流动性也无显著改变[20-21]。已知PUFA尤其是DHA和DPA，可以促进精子质膜的流动性。精子冷冻保存的成功率与质膜流动性关系是：精子质膜适度的流动性有助于冷冻保护剂进入精子细胞内和精子细胞脱水，但是过高的流动性会损害精子的完整性。本研究所选用精液均为捐精者的正常精液，外源性添加DHA与其他各组发生差异的组也是DHA 3组，即摩尔浓度最高组，可能原因就是DHA浓度高导致精子膜流动性也高，反而不能提高人精子冷冻前后的运动学参数。已有研究显示[14]，精液参数正常的人精子膜的n-3 PUFA，特别是DHA含量，顯著高于少精症、弱精子症、少弱精子症患者。所以根据本研究提示的结果，可以进一步研究外源性添加DHA对少精症、弱精子症、少弱精子症患者精液的冷冻效果是否有利；也可以进一步探索对参数正常人精液冷冻保存最佳的DHA添加浓度以及人精子冷冻保护剂中单独添加DHA后对人精子运动学参数以外的影响，如DNA碎片率等。

目前有关DHA对精液影响的研究主要集中在两个途径，即膳食添加和直接添加到精液。多数动物实验提示[1-6]，膳食添加n-3 PUFA可以改变精子膜的脂肪酸组成，特别是提高DHA的含量，从而改善新鲜和冻后精液质量。除了饮食添加DHA，有学者尝试在绵羊冷冻保护液里直接添加深海鱼油PUFA（主要成分是DHA和EPA）[7]，由于其具有强的膜通过性，渗透入精子细胞对头部保护，防止了酶的渗出和钙离子的流入，使解冻后的绵羊精子活力和顶体完整率明显高于未添加PUFA的对照组。上述两种途径添加DHA又分别有单独添加和联合添加两种。虽然单独添加PUFA在某些物种显示出了一定的改善精子功能的工作，但也有一些研究显示，联合使用L-半胱氨酸能明显改善解冻后精液质量，特别是精子的运动能力和完整性，PUFA联合使用维生素E直接添加到冷冻保护液[22]能使PUFA的精子保护作用更稳定。尽管如此，近期陆续有研究报道膳食添加n-3或n-6 PUFA后不论新鲜精液还是冻后精液参数均无改善[17-21，23]，这与本文的研究结果类似。整理相关文献后发现，出现结论不一致的原因可能是DHA发挥相关作用与物种有关，同样地添加途径在不同物种间发挥的作用可能不同，也可能与PUFA添加的种类和纯度有关。

目前，有关PUFA尤其是与精子生理功能密切相关的n-3 PUFA对人精子影响的研究处于起步阶段。本研究仅对人冷冻保护剂中单独添加DHA（n-3 PUFA的1种）对人精子运动学参数的影响进行了初步探索，有关正常和不育人群单独添加DHA或联合添加n-3 PUFA和抗氧化剂对冻后精液影响的研究正在进一步探索中，通过这些研究将会越来越了解以DHA为代表的n-3 PUFA在人精子冷冻保存中可能发挥的作用。

[參考文献]

[1]Ferramosca A，Moscatelli N，Di Giacomo M，et al.Dietary fatty acids influence sperm quality and function[J].Andrology，2017，5（3）：423-430.

[2]Tran LV，Malla BA，Sharma AN，et al.Effect of omega-3 and omega-6 polyunsaturated fatty acid enriched diet on plasma IGF-1 and testosterone concentration，puberty and semen quality in male buffalo[J].Anim Reprod Sci，2016，173：63-72.

[3]Liu Q，Zhou YF，Duan RJ，et al.Dietary n-6：n-3 ratio and vitamin E improve motility characteristics inassociation with membrane properties of boar spermatozoa[J].Asian J Androl，2017，19（2）：223-229.

[4]Khoshvaght A，Towhidi A，Zare-shahneh A，et al.Dietary n-3 PUFA improve fresh and post-thaw semen quality in Holstein bulls via alteration of sperm fatty acid composition[J].Theriogenology，2016，85（5）：807-812.

[5]Adibromadi M，Najafi MH，Zeinoaldini S，et al.Effect of dietary soybean oil and fish oil supplementation on blood metabolites and testis development of male growing kids[J].Egypt J Sheep Goat Sci，2012，7：19-25.

[6]Jafaroghli M，Abdi-Benemar H，Zamiri MJ，et al.Effects of dietary n-3 fatty acids and vitamin C on semen characteristics，lipid composition of sperm and blood metabolites in fat-tailed Moghani rams[J].Anim Reprod Sci，2014，147（1-2）：17-24.

[7]杨健，王丽芳，孙彩霞，等.绵羊精液稀释液中添加PUFA对冷冻精液品质的影响[J].广东畜牧兽医科技，2011，36（2）：15-17.

[8]Vireque AA，Tata A，Silva OF，et al.Effects of n-6 and n-3 polyunsaturated acid-rich soybean phosphatidylcholine on membrane lipid profile and cryotolerance of human sperm[J].Fertil Steril，2016，106（2）：273-283.

[9]谷翊群，陈振文，卢文红，等.世界卫生组织人类精液检查与处理实验室手册[M].5版.北京：人民卫生出版社，2014：142-145.

[10]Esmaeili V，Shahverdi AH，Moghadasian MH，et al.Dietary fatty acids affect semen quality：a review[J].Andrology，2015， 3（3）：450-461.

[11]Van Tran L，Malla BA，Kumar S，et al.Polyunsaturated fatty acids in male ruminant reproduction -a review[J].Asian-Australas J Anim Sci，2017，30（5）：622-637.

[12]Minguez-Alarcón L，Chavarro JE，Mendiola J，et al.Fatty acid intake in relation to reproductive hormones and testicular volume among young healthy men[J].Asian J Androl，2017，19（2）：184-190.

[13]Ramos Angrimani DS，Nichi M，Losano JDA，et al.Fatty acid content in epididymal fluid and spermatozoa during sperm maturation indogs[J].J Anim Sci Biotechnol，2017，8：18.

[14]Martinez-Soto JC，Landeras J，Gades J.Spermatozoa and seminal plasma fatty acids as predictors of cryopreservation success[J].Andrology，2013，1（3）：365-375.

[15]Aurich C，Ortega Ferrusola C，Pena Vega FJ，et al.Seasonal changes in the sperm fatty acid composition of Shetland pony stallions[J].Theriogenology，2018，107：149-153.

[16]Safarinejad MR.Effect of omega-3 polyunsaturated fatty acid supplementation on semen profile and enzymatic anti-oxidant capacity of seminal plasma in infertile men with idiopathic oligoasthenoteratospermia：a double-blind，placebo-controlled，randomised study[J].Andrologia，2011，43（1）：38-47.

[17]Martínez-Soto JC，Domingo JC，Cordobilla B，et al.Dietary supplementation with docosahexaenoic acid （DHA） improves seminalantioxidant status and decreases sperm DNA fragmentation[J].Syst Biol Reprod Med，2016，62（6）：387-395.

[18]Andriola YT，Moreira F，Anastácio E，et al.Boar sperm quality after supplementation of diets with omega-3 polyunsaturatedfatty acids extracted from microalgae[J].Andrologia，2017，50（1）：12825.

[19]Losano JDA，Angrimani DSR，Dalmazzo A，et al.Effect of vitamin E and polyunsaturated fatty acids on cryopreserved sperm quality in bos taurus bulls under testicular heat stress[J].Anim Biotechnol，2017，28（3）：1-10.

[20]Byrne CJ，Fair S，English AM，et al.Dietary polyunsaturated fatty acid supplementation of young post-pubertal dairybulls alters the fatty acid composition of seminal plasma and spermatozoa but hasno effect on semen volume or sperm quality[J].Theriogenology，2017，90：289-300.

[21]Fair S，Doyle DN，Diskin MG，et al.The effect of dietary n-3 polyunsaturated fatty acids supplementation of rams on semen quality and subsequent quality of liquid stored semen[J].Theriogenology，2014，81（2）：210-219.

[22]楊健，刘德全，王丽芳，等.稀释液中添加多不饱和脂肪酸（PUFA）对绵羊精液冷冻效果的影响[J].畜牧与饲料科学，2010，31（11-12）：6-7.

[23]Kokoli AN，Lavrentiadou SN，Zervos IA，et al.Dietary omega-3 polyunsaturated fatty acids induce plasminogen activator activity and DNA damage in rabbit spermatozoa[J].Andrologia，2017，49（10）：e12776.

（收稿日期：2017-12-18 本文编辑：祁海文）