乳酸菌冻干工艺的设计

李玲　赵耀　曹珂珂

摘 要：目的：以乳酸菌为研究对象，研究设计其冻干工艺。方法：采用响应面法优化筛选出真空冷冻干燥的保护剂配方。结果：单因素实验结果表明脱脂乳、麦芽糊精和葡萄糖3种保护剂保护效果较好，以细胞存活率为响应值，筛选出最佳复合保护剂为脱脂乳9.51%，麦芽糊精7.77%，葡萄糖7.56%。结论：通过试验测得冻干后的存活率可达到90.08%，与预测值90.8303%接近。

关键词：乳酸菌；真空冷冻干燥；保护剂；存活率

中图分类号 Q935 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2017）14-0043-03

Abstract：Objective：The research aimed to study the freeze-drying process of lactic acid bacteria. Method：The response surface method was used to optimize the protective agent for vacuum freeze - drying.Result：The results of single factor experiments showed that the protective effect of defatted milk， maltodextrin and glucose was better， and the best survival rate was 9.51%，maltodextrin was 7.77%，7.56% glucose.Conclusion：The survival rate of the freeze-dried method was 90.08%， which was close to the predicted value of 90.8303%.

Key words：Lactic Acid Bacteria；Freeze-drying；Protectant；Survival rate

近年来，由于微生物学的迅速发展，乳酸菌得到了广泛的研究和开发，它对机体多方面的保健功能逐渐得到了人们的重视[1]。目前，乳酸菌在乳制品的生产中已经得到了广泛的应用，它可作为发酵剂用于酸奶、大豆酸奶、乳饮料等乳制品的生产。乳酸菌冻干粉的制备通常采用真空冷冻干燥技术，而在冷冻干燥过程中，对菌体的损伤是不可避免的，所以添加适宜的保护剂提高菌种的存活率对乳制品工艺生产具有十分重要的意义[2]。为此，本研究选取5种保护效果较好的冻干保护剂作为实验对象，通过单因素实验选择3种效果较好的冻干保护剂，然后采用 Design-Expert8.0.6软件的中响应面试验建立数学模型确定最佳冻干保护剂配方[3-6]。

1 材料和方法

1.1 实验材料与仪器

1.1.1 菌种 乳球菌属（Lactococcus）C1菌株，由同组实验同学从酸奶、泡菜中分离而得，并保存在实验室冰箱供使用。

1.1.2 培养基 MRS液体培养基（用于菌种的传代、扩培和种子液制备）、MRS固体培养基（用于菌落计数），均由上海星科生物科技有限公司生产。

1.1.3 主要药品 葡萄糖、谷氨酸钠、维生素C、麦芽糊精、脱脂乳。

1.1.4 主要仪器与设备 BHC-1300IIA/B2-生物洁净安全柜、DY04-12-44-00-立式压力蒸汽灭菌器筒、YPB1003-电子天平、JW-3021H-High Speed Centrifuge、CVC FD8-5-冷冻干燥机、BC-50S-冰箱。

1.2 方法

1.2.1 工艺流程 菌种活化→制备菌液→离心收集菌体（称重）→加入保护剂溶液→计活菌数（cfu/mL）→分装→冰箱预冻（24h）→真空冷冻干燥→复水→计活菌数（cfu/mL）→计算存活率[7]。

1.2.2 菌种活化 取出冰箱里面冷藏的乳酸球菌，以3%的接种量接到100mLMRS液体培养基（灭菌）做第一次活化，经37℃恒温培养24h后，吸取300μL涂平板检测菌种的纯度并记录下活菌数，然后进行第二次活化。

1.2.3 活菌测定 以MRS固体培养基为计数培养基，采用梯度稀释平板法计数[8]测活菌数。

1.2.4 菌体制备 通过查阅大量文献确定最佳离心条件（4℃，6000r/min，15min）[9]。取8个50mL的无菌离心管，等量移入40mL菌液，在最佳离心条件下进行平衡离心。离心完毕后，取沉淀，用与上述菌液等体积的无菌生理盐水（用于洗涤菌体）溶解沉淀菌体，进行第二次离心，最终得到乳酸菌泥。

1.2.5 真空冷冻干燥 将平皿先放入4℃冰箱平衡30min，然后放置-40℃冰箱中进行预冷冻20h。冷冻完成后放入真空冷冻干燥机中，设置温度-50℃，抽真空（20～40Pa），干燥24h。

1.2.6 存活率的测定 将充分干燥成粉末的菌体取出后自然解冻，加入13.3mL灭菌的生理盐水复水30min，用微量移液器吸取与冻干前等量的1mL菌液进行稀释涂板计数。测定冻干前后的活菌数目，得出3组平行实验的平均值，最终计算求得保护剂的冷冻存活率[10]。计算公式为：存活率（%）=复水冻干后的活菌数/样品冻干后的活菌数×100

1.2.7 试验设计 通过单因素试验确定3种对乳酸菌保护效果较好的保护剂，然后采用Box-Behnken实验设计，进行响应面实验，最终确定最佳复合保护剂，并进行结果验证。

2 结果与分析

2.1 单因素保护剂的结果与分析 根据保护剂对菌体冷冻干燥的保护机理，结合有关文献报道[11-13]，选取脱脂乳、麦芽糊精、葡萄糖、维生素C、谷氨酸钠作为单因素保护剂，以存活率为目标，研究它们对乳酸菌的冻干保护效果，通过单因素實验，选取最优的保护剂浓度列表，结果如表1所示。单因素实验结果显示，脱脂乳、麦芽糊精和葡萄糖这3种保护剂对菌体保护效果较好，其中脱脂乳作为保护剂的影响最显著，其次是麦芽糊精与葡萄糖，其他保护剂保护效果并不是很理想。因此选取脱脂乳、麦芽糊精和葡萄糖为优化因子，然后根据结果确定它们各自的添加量，进行复合保护剂的优化。

2.2 Box-Behnken实验设计结果与响应面分析

2.2.1 响应面实验因子与水平 根据单因素实验结果，进行三因素三水平响应面实验，表2为试验因素与水平编码表。

2.2.2 响应面实验设计与结果 详见表3。

2.2.3 回归模型与方差分析 对表3的实验结果进行回归分析，编码值A、B、C分别代表葡萄糖、脱脂乳和麦芽糊精，方差分析数据如表4所示。

2.00AB-2.70AC+1.82BC-1.38A2-3.71B2-4.86C2。

由表4可知，回归方程失拟项显示不显著（P=0.0881）且大于0.05，无失拟数据存在，实验与模型拟合效果较好，说明此次的实验值与预测值误差小。模型中F=28.12、P<0.0001、R2=0.9731、R2adj=0.9385，表明模型是较显著的，有很好的实验意义。从表4可知，只有C2的P值小于0.001，表示C2影响最为显著，A2、B2的P值均小于0.05说明A2、B2对存活率也有显著影响。一次项B的P值=0.001小于0.05，而A、C项的P值均大于0.05，所以葡萄糖和麦芽糊精对存活率没有显著影响。交互项的P值均小于0.05，所以葡萄糖与脱脂乳、葡萄糖与麦芽糊精、脱脂乳与麦芽糊精对响应值的交互影响都显[14]。

2.2.4 响应曲面图及等高线图的分析 图1～3为Design-Expert8.0.6软件设计得出等高线图和其对应的3D图，从图中能够直观地看出葡萄糖、脱脂乳、麦芽糊精对存活率的影响程度和它们两两之间的交互作用。在等高线图中，椭圆型或马鞍型的高线表示显著，而圆型的等高线表示较不显著[15]。

由图1可见，等高线呈椭圆形，表明葡萄糖和脱脂乳交互影响显著。当麦芽糊精浓度为7.5%时，脱脂乳浓度范围在7.5%～9.51%，葡萄糖浓度范围在6%～7.56%时，冻干粉的存活率一直在增长，达到峰值后，增長趋势越来越缓慢。当脱脂乳浓度为9.51%时，葡萄糖浓度为7.56%时，响应值达到最高点。

由图2可见，等高线也呈椭圆形，说明麦芽糊精与葡萄糖交互作用也显著，当脱脂乳浓度为11.5%时，麦芽糊精浓度范围5.5%～7.77%，葡萄糖浓度范围在6%～7.56%时，冻干粉的存活率一直在增长，达到峰值后，增长趋势越来越缓慢。当麦芽糊精浓度为7.77%时，葡萄糖浓度为7.56%时，此时的存活率达到最大。

由图3显示，等高线呈椭圆形并不明显，说明脱脂乳与麦芽糊精交互作用相比上述因素之间较不显著，当葡萄糖浓度为9%时，脱脂乳浓度范围在7.5%～9.51%时，麦芽糊精浓度范围在5.5%～7.77%，响应值一直在提高，达到峰值后，增长趋势越来越缓慢。当麦芽糊精浓度为7.77%时，葡萄糖浓度为7.56%时，此时的存活率达到最大。

2.3 验证实验 通过Design-Expert8.0.6软件计算得到，当葡萄糖浓度为7.56%、脱脂乳浓度为9.51%、麦芽糊精浓度为7.77%时，存活率达到预测最大值为90.8303% 在此条件下平行实验3次，求得平均值为90.08%，相对误差为0.83%，实测值与预测值有稍许差异，表明响应面法得到的数学模型基本可靠。

3 结论

通过单因素实验找出了脱脂乳、葡萄糖、麦芽糊精3个单因素作为优化因子，然后结合响应面法，找出存活率达到最高时的最佳复配保护剂为：当葡萄糖浓度为7.56%、脱脂乳浓度为9.51%、麦芽糊精浓度为7.77%，在此条件下预测值为90.8303%。通过验证试验，得出的存活率为90.08%。相对误差值为0.83%，复配保护剂的存活率90.08%与不加保护剂时相比有非常明显提高。

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（责编：张宏民）