淫羊藿苷对MC3T3-E1成骨前体细胞的成骨诱导作用及意义

王建茹，张育敏，韩波(山西医科大学，太原030006；山西中医药大学)

肿瘤、先天畸形、创伤等各种原因均可造成骨缺损，理想的骨修复材料应具有良好的骨传导性和骨诱导能力[1,2]。但是目前临床应用的羟基磷灰石、磷酸钙、碳酸钙仅具备骨传导性，植入后易出现骨不连和延迟愈合。研究发现，骨修复材料与骨形态发生蛋白(BMP)等生长因子复合后具有骨诱导性能，但BMP等生长因子制备工艺复杂、价格昂贵，且活性不稳定，具有潜在致癌风险等缺点[3,4]。淫羊藿具有补肾壮阳、祛风除湿、强筋健骨等功效，常用于治疗骨质疏松、更年期综合征等疾病[5,6]。淫羊藿苷为淫羊藿的主要活性成分[7]。现代药理学研究证实，淫羊藿能促进骨髓间充质干细胞向骨细胞分化，并提高DNA形成和骨组织蛋白质合成[8,9]。2016年7月～2017年7月，本研究观察了淫羊藿苷对MC3T3-E1成骨前体细胞的成骨诱导作用，并确定其最佳作用浓度，旨在为其用于骨组织再生提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料 细胞：MC3T3-E1成骨前体细胞株(中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)。主要试剂：淫羊藿苷标准品(纯度>98%，中国药品生物制品检定所)，标准胎牛血清(Hyclone，美国)，DMEM高糖培养基(Gibco，美国)，胰酶(Sigma，美国)，碱性磷酸酶(ALP)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)，钙测定试剂盒(长春汇力生物技术有限公司)，死/活细胞荧光染色试剂盒(天津卫凯生物工程有限公司)，骨形态发生蛋白2(rhBMP-2，北京百灵克公司)，其余试剂均为国产分析纯。主要仪器：SterilGARDⅢ超净工作台(Baker，美国)，CO2细胞培养箱(Heraeus，美国), 酶联免疫检测仪(Bio-Rad，美国)，高压灭菌器(Hirayama，德国)，倒置相差显微镜(Olympus，日本)，Nikon Eclipse TE2000-U荧光显微镜(Nikon，日本)。

1.2 淫羊藿苷溶液配制 将67.67 mg淫羊藿苷加入10 mL二甲基亚砜(DMSO)，配制成10 mmol/L的储存液。储存液中加入不同体积的培养液配制成终浓度分别为1×10-6、1×10-5、1×10-4、1×10-3、1×10-2mmol/L的工作液。

1.3 细胞分组处理 37 ℃、5% CO2培养箱中采用10% FBS DMEM高糖培养基复苏MC3T3-E1细胞，适当传代后，制备细胞悬液，并调整细胞密度为1×104/mL。将细胞随机分为观察组、阴性对照组及阳性对照组。观察组分别加入终浓度为1×10-6、1×10-5、1×10-4、1×10-3、1×10-2mmol/L淫羊藿苷溶液100 μL，阴性对照组及阳性对照组分别加入等体积含DMSO的培养基及rhBMP-2。

1.4 淫羊藿苷对MC3T3-E1细胞的毒性观察

1.4.1 细胞增殖能力 采用MTT法。取100 μL MC3T3-E1细胞悬液接种到96孔板，DMEM培养基培养24 h，待细胞贴壁后，去除培养基。参照1.3的方法进行分组处理，每2天更换2/3培养基。分别于培养第3、7天每孔加入50 mg/mL的MTT液20 μL，继续培养4 h；吸出孔中培养液，每孔再加入DMSO 150 μL，震荡10 min，使结晶物充分溶解。酶标仪检测各孔570 nm波长处的光密度(OD)值。以加入正常培养基的细胞作为正常对照孔，计算细胞增殖率。细胞增殖率=OD实验孔/OD正常对照孔×100%。

1.4.2 细胞活力 采用死/活细胞荧光染色法。取500 μL MC3T3-E1细胞悬液接种到24孔板，DMEM培养基培养24 h，待细胞贴壁后，去除培养基。参照1.3的方法进行分组处理，加入药物体积均为500 μL，37 ℃、5% CO2培养箱培养48 h。去除培养基，参照死/活细胞荧光染色试剂盒说明书进行操作，Calcein-AM可将活细胞染成绿色，EthD-1可将死亡细胞染成红色。5 min后荧光显微镜观察活细胞与死细胞情况，采用Image pro plus 6.0图像分析软件计数3个视野内死细胞与活细胞数，计算细胞存活率。细胞存活率=活细胞数/(活细胞数+死细胞数)×100%。

1.5 淫羊藿苷对MC3T3-E1细胞成骨分化影响的观察

1.5.1 细胞钙化情况 采用茜素红钙结节染色。取100 μL MC3T3-E1细胞悬液接种到24孔培养板，DMEM培养基培养24 h，待细胞贴壁后，去除培养基，参照1.3的方法进行分组处理。每组设置5个复孔，每3天换液1次，每次换液量为培养液的2/3，培养2周。采用茜素红S染色法检测MC3T3-E1细胞是否形成钙化结节，方法如下：将1 g茜素红溶于100 mL蒸馏水中，用氨水将pH值调整为6.36～6.40。无钙、镁PBS冲洗3遍，收集细胞，10%甲醛溶液(用PBS溶解)固定1 h，蒸馏水冲洗5遍，茜素红溶液染色5 min。倒置相差显微镜下观察染色钙化结节形成情况。

1.5.2 ALP活性、钙含量及骨钙素表达 采用细胞超声裂解法。参照1.5.1的方法分组处理细胞，培养2周后，用无钙、镁Hanks液清洗贴壁细胞2遍，胰酶消化收集细胞。用无钙、镁Hanks液清洗细胞2遍(1 000 r/min离心2 min)，加入0.2%Nonidet P-40 (NP-40)1 mL重新悬浮细胞，在冰浴中超声裂解2 min，将细胞裂解液冻存于-20 ℃待用。ALP活性、钙含量及骨钙素检测均严格按照各试剂盒说明书进行操作。

2 结果

2.1 各组细胞增殖能力及细胞活力比较 培养第3天，加入1×10-2mmol/L淫羊藿苷的观察组细胞增殖率明显低于阴性对照组及阳性对照组(P均<0.05)。培养第7天，加入1×10-3、1×10-2mmol/L淫羊藿苷的观察组细胞增殖率明显低于阴性对照组及阳性对照组(P均<0.05)。加入1×10-3mmol/L淫羊藿苷的观察组细胞存活率明显低于阳性对照组，加入1×10-2mmol/L淫羊藿苷的观察组细胞存活率明显低于阴性对照组及阳性对照组(P均<0.05)。见表1。

表1 各组细胞增殖率及细胞存活率比较

注：与同组第3天比较，*P<0.05；与阴性对照组比较，#P<0.05；与阳性对照组比较，△P<0.05。

2.2 各组细胞钙化情况比较 阴性对照组未见明显红染钙化结节，阳性对照组有明显的钙化结节，细胞呈聚集样生长，在汇集的中央首先出现钙化结节。观察组随着加入淫羊藿苷浓度的升高，红染钙化结节面积逐渐增大，其中加入1×10-6、1×10-5mmol/L淫羊藿苷的观察组仅见散在钙化结节；当淫羊藿苷浓度≥1×10-4mmol/L时，钙化红染区域逐渐连接成片。

2.3 各组ALP活性、钙含量及骨钙素表达比较 随着加入淫羊藿苷溶液浓度的升高，观察组ALP活性、钙含量及骨钙素表达均逐渐升高。加入不同浓度淫羊藿苷的观察组细胞ALP活性均高于阴性对照组、低于阳性对照组(P均<0.05)。加入1×10-4、1×10-3、1×10-2mmol/L淫羊藿苷的观察组细胞钙含量均高于阴性对照组，加入1×10-6、1×10-5、1×10-4mmol/L淫羊藿苷的观察组细胞钙含量均低于阳性对照组(P均<0.05)。加入不同浓度淫羊藿苷溶液的观察组细胞骨钙素表达均高于阴性对照组，加入1×10-6、1×10-5mmol/L淫羊藿苷的观察组细胞骨钙素表达均低于阳性对照组(P均<0.05)。见表2。

表2 各组ALP活性、钙含量及骨钙素表达比较

注：与阴性对照组比较，*P<0.05；与阳性对照组比较，#P<0.05。

3 讨论

淫羊藿苷作为传统补益类中药，常被用于治疗骨骼疾病。康学等[10]采用含淫羊藿的骨松宝胶囊治疗40例骨质疏松患者，结果显示患者治疗后骨密度升高。朱贵忱等[11]将80例骨质疏松患者随机分为钙尔奇D组和钙尔奇D联合淫羊藿颗粒组，治疗6个月显示，钙尔奇D联合淫羊藿颗粒组临床有效率、腰背痛缓解时间、血清骨钙素水平及骨密度均明显优于钙尔奇D组，并认为淫羊藿能促进成骨细胞成骨作用。既往大量研究证实，淫羊藿中的淫羊藿苷成分可能在促进成骨方面发挥主要作用[12,13]。

细胞毒性和成骨诱导活性是评价骨诱导材料安全性和有效性的重要指标[14]。本研究结果显示，培养第3天加入1×10-2mmol/L淫羊藿苷的观察组细胞增殖率明显低于阴性对照组及阳性对照组；培养第7天，加入1×10-3、1×10-2mmol/L淫羊藿苷的观察组细胞增殖率明显低于阴性对照组及阳性对照组；加入1×10-3mmol/L淫羊藿苷的观察组细胞存活率明显低于阳性对照组，加入1×10-2mmol/L淫羊藿苷的观察组细胞存活率明显低于阴性对照组及阳性对照组。证实1×10-6～1×10-4mmol/L的淫羊藿苷对MC3T3-E1细胞毒性较小，安全性较高。细胞在体外向成骨细胞方向诱导分化时，主要经历细胞增殖期和细胞分化期。细胞适应培养条件后大量增殖，进入生长增殖期，随即细胞数量增多，开始呈多层重叠生长，细胞界限变模糊；在诱导环境下，细胞进入分化期，开始分泌胶原蛋白、ALP等，促使钙在细胞外基质内沉积，形成钙化结节。增殖和分化是细胞生命活动的两个方面，增殖中的细胞其分化功能受到抑制，而分化中的细胞其增殖能力降低。当细胞分化后，就失去增殖的潜能[15]。本研究加入1×10-2mmol/L淫羊藿苷溶液的观察组培养第7天细胞增殖率明显低于培养第3天，也间接证实了在细胞增殖过程中存在部分细胞的分化，而细胞分化又进一步降低了细胞增殖率。

ALP 是一种钙结合转运蛋白，分布于细胞膜，具有促进细胞成熟、钙化的功能，为成骨分化的早期标志物，其出现于基质合成期，于钙化期达到高峰[16]。ALP 活性越高代表成骨前体细胞向成熟骨细胞的分化越明显，因此ALP 活性常作为一个重要指标来评价成骨细胞的分化程度。Ca含量是成骨细胞分化的另一重要指标。骨钙素是由非增殖期成骨细胞合成和分泌的一种特异性非胶原骨基质蛋白，能保持骨的矿化速度，是成骨细胞成骨功能的敏感标志物。本研究结果显示，加入不同浓度淫羊藿苷的观察组ALP活性均高于阴性对照组、低于阳性对照组；加入1×10-4、1×10-3、1×10-2mmol/L淫羊藿苷的观察组细胞钙含量均高于阴性对照组，加入1×10-6、1×10-5、1×10-4mmol/L淫羊藿苷的观察组细胞钙含量均低于阳性对照组，加入不同浓度淫羊藿苷的观察组细胞骨钙素表达均高于阴性对照组。说明1×10-4mmol/L淫羊藿苷具有升高MC3T3-E1细胞钙含量和骨钙素表达的作用，且对细胞的毒性作用较小，是淫羊藿苷用于修复骨缺损的一个安全、有效剂量。

综上所述，1×10-4mmol/L淫羊藿苷溶液对MC3T3-E1细胞的细胞毒性较低，其成骨诱导作用与rhBMP-2接近，可作为一种骨诱导生长因子替代剂联合骨修复材料用于促进骨组织再生。关于淫羊藿苷与临床常用的骨修复材料复合用于促进骨再生的效果仍需后续实验加以证实。

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