淫羊藿苷与透明质酸结合物的制备及其对膝关节软骨缺损兔软骨组织的保护作用

张君涛，张栋林，吴超超，张超，李思迪，原续波，尚曼(天津中医药大学第一附属医院，天津0080；天津中医药大学；天津大学；天津医科大学)

淫羊藿苷是中药淫羊藿的主要有效成分，能够促进成骨细胞增殖与分化、抑制破骨细胞增殖与分化，亦可提高软骨细胞代谢活性，促进软骨细胞增殖[1,2]。关节腔内注射透明质酸可覆盖和保护关节软骨，改善关节挛缩，抑制软骨表面变性，改善病理性关节液分泌，从而发挥润滑关节的作用[3]。淫羊藿苷和透明质酸在骨科治疗中均有一定疗效，但作用机理有所差别。理论上二者结合可更好地发挥功效。淫羊藿苷和透明质酸结合物的制备方法一直是临床相关的难点及热点。研究发现，兔的关节软骨更接近于人的关节软骨，且兔关节炎模型中的软骨退变情况也更接近于人的软骨退变情况[4]。2017年5～8月，本研究采用化学合成的方法制备淫羊藿苷与透明质酸结合物，并观察其对膝关节软骨缺损兔软骨组织的保护作用。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 动物：6月龄健康新西兰兔24只，雌雄不限，体质量约2.5 kg。药物：淫羊藿苷(纯度≥98%)，上海融禾医药科技发展有限公司。透明质酸(纯度98%)，北京索莱宝科技有限公司。透明质酸钠(含1%透明质酸)：国药准字H10960136，山东博士伦福瑞达制药有限公司。淫羊藿苷含药血清冻干粉：参照前期研究[5]对成年新西兰兔灌胃给予淫羊藿苷后获得含药血清，低温无菌冻干。

1.2 淫羊藿苷与透明质酸结合物的制备[6～8]

1.2.1 甘氨酸氨基保护 将2 mmol甘氨酸(Gly)溶解在20 mL NaHCO3溶液中(质量分数为1.68%)，室温下搅拌1～2 h。将0.45 g二碳酸二叔丁基酯溶解在2 mL二氧六环中，在冰浴中不断搅拌的条件下，把二碳酸二叔丁基酯溶液缓慢滴加至Gly溶液中，控制滴速，在10 min内滴加完毕，室温反应20 h。用0.01 mol HCl调节上述反应后溶液的pH至中性，旋转蒸发仪除去溶剂，将余下固体用二氯甲烷(DCM)溶解，并除去不溶物质。将DCM中溶解的反应产物滴加至10倍体积的冷乙醚中沉淀，通过抽滤收集固体产物，并采用冷乙醚多次洗涤，最后置于真空干燥箱中干燥，得到叔丁氧羰基甘氨酸叔丁酯。甘氨酸氨基保护的化学方程式见图1。

图1 甘氨酸氨基保护的化学方程式

1.2.2 淫羊藿苷与叔丁氧羰基甘氨酸叔丁酯的脱水缩合反应 将淫羊藿苷加入到四氢呋喃(THF)和吡啶的混合溶液中，不断搅拌至完全溶解，加入一定量叔丁氧羰基甘氨酸叔丁酯，剧烈搅拌1 h；缓慢加入二环己基碳二亚胺(DCC)和二甲基氨基吡啶(DMAP)的四氢呋喃溶液，室温下搅拌反应24 h；加入20 mL去离子水，抽滤，洗涤，尽量除去不溶物质；通过旋转蒸发仪使溶液浓缩，再将浓缩后的溶液于水中沉淀，将沉淀溶解于THF和吡啶的混合溶液中；加水，冷冻过夜，将不溶物质除去，浓缩，加水析出沉淀。如此反复3次，得到产物。淫羊藿苷与叔丁氧羰基甘氨酸叔丁酯脱水缩合反应的化学方程式见图2。

图2 淫羊藿苷与叔丁氧羰基甘氨酸叔丁酯脱水缩合反应的化学方程式

1.2.3 脱除叔丁氧羰基保护 取1.2.2制备的产物5 g，加入至9 mL三氟乙酸(TFA)和10 mL DCM的混合溶液中，室温下搅拌1～2 h；旋转蒸发仪除去DCM，所得固体用乙酸乙酯溶解，5%碳酸钠(NaCO3)洗涤并调整pH为8～9，除去溶剂，得到第三步反应产物氨基淫羊藿苷。脱除叔丁氧羰基保护的化学方程式见图3。

图3 脱除叔丁氧羰基保护的化学方程式

1.2.4 氨基淫羊藿苷与透明质酸的偶联 将透明质酸加入蒸馏水中，向其中缓慢滴加氨基淫羊藿苷(淫羊藿苷的氨基与透明质酸的羧基摩尔比理论上为1∶1～1∶n，本实验选用1∶10)，并向其中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC，10 mg/mL)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS，10 mg/mL)。将溶液pH调至4.5，室温下搅拌反应20 min，再将pH调至5.5，室温下搅拌24 h。利用柱层析分离得到最终产物，即淫羊藿苷与透明质酸的结合物。氨基淫羊藿苷与透明质酸偶联的化学方程式见图4。

1.3 淫羊藿苷与透明质酸结合物对膝关节软骨缺损兔软骨组织及胶原表达的影响

1.3.1 兔膝关节软骨缺损模型制备 参照Charalambous等[9]的方法制备兔膝关节软骨缺损模型，方法如下：将24只健康成年新西兰兔用速眠新麻醉成功后，仰卧位固定四肢及头部于专用解剖台上。右侧膝关节备皮，医用碘伏常规消毒，铺无菌手术巾。右大腿上段上止血带，于髌骨旁内侧作一纵行切口长约3 cm。依次切开皮肤、皮下组织及筋膜，关节囊纵形切开，暴露膝关节面，小心避开主要血管、神经。将髌骨及股四头肌腱翻向外侧，清晰显露股骨髌面。用直径为3.2 mm的骨科手术电钻，于股骨内髁关节软骨面负重区中央处钻一直径为4 mm的全层软骨缺损，深度约3 mm，以缺损区域渗血为标准。手术区域生理盐水冲洗干净，0#线全层缝合，无菌敷料包扎。实验动物麻醉苏醒后，笼中自由活动。术前1 h及术后连续3 d肌肉注射青霉素40 000 U/次，1次/d，以预防感染。

图4 氨基淫羊藿苷与透明质酸偶联的化学方程式

1.3.2 分组处理 将24只膝关节软骨缺损兔随机分为空白对照组、透明质酸钠组、淫羊藿苷组、结合物组，各6只。模型制备后第3周，空白对照组、透明质酸钠组、淫羊藿苷组、结合物组右侧膝关节腔内分别注射0.2 mL生理盐水、1%透明质酸钠注射液、淫羊藿含药血清冻干粉(按7 mL血清对应的冻干粉量)溶液及淫羊藿苷与透明质酸结合物(淫羊藿苷含量同淫羊藿苷组)；1次/周，共5周。注射药物后实验动物行被动屈伸膝关节运动，使药物分布均匀。

1.3.3 相关指标检测 ①膝关节大体形态：各组分别于术后第4、8、12周采用空气栓塞法各处死2只，切开膝关节。将取出的股骨内髁软骨缺损修复区域标本用生理盐水冲洗干净，仔细观察其大体形态，并根据ICRS评分标准[10]对股骨内髁软骨缺损修复区域的色泽、轮廓、完整性以及关节内有无粘连、增生、肿胀等进行评分。ICRS评分包括软骨表面、软骨基质、细胞分布、细胞群发育能力、软骨下骨和软骨矿化各3分，共18分，评分越高表明软骨缺损修复越好。②软骨组织病理学改变[11]：各组术后第12周处死并进行膝关节大体形态观察后，将股骨内髁软骨缺损修复区域进行固定、脱钙，常规石蜡包埋，制成5 μm厚的软骨全层切片。乙醇梯度脱水，二甲苯透明，常规HE染色。光学显微镜下观察股骨内髁软骨缺损修复区域的结构完整性，细胞肿胀、增生、变异程度，血管翳生成情况，并进行Pineda组织学半定量评分[12]。Pineda组织学半定量评分包括缺损填充度4分、骨软骨连接部重建情况2分、基质染色4分、细胞形态3分、与宿主周围细胞的完整性连接情况2分，共15分，评分越低表明软骨缺损修复情况越好。③软骨组织Ⅱ型胶原表达[13]：取②中制备的软骨全层切片，行甲苯胺蓝染色，染色后软骨细胞质内可见紫红色异染颗粒。Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色后采用抗原-抗体特异性反应检测Ⅱ型胶原表达情况，阳性可见棕褐色颗粒沉着。计算Ⅱ型胶原阳性表达率。

2 结果

2.1 各组膝关节大体形态比较 术后第12周，空白对照组膝关节软骨表面的缺损区外形修复不完全，表面不平，质地较软，弹性较差，股骨内髁关节软骨面不完整，可见软骨下骨暴露。结合物组膝关节软骨表面缺损区外形基本完全修复，关节软骨表面较光滑，呈乳白色，关节内未见明显粘连，软骨退变程度较轻，股骨内髁关节软骨面恢复较好。透明质酸钠组和淫羊藿苷组膝关节软骨面修复接近完整，但关节软骨表面不平，与结合物组相比恢复稍差。各组术后不同时间点膝关节ICRS评分比较见表1。

表1 各组术后不同时间点膝关节ICRS评分比较

注：与空白对照组同时间点比较，#P<0.05；与透明质酸钠组同时间点比较，&P<0.05；与淫羊藿苷组同时间点比较，△P<0.05。

2.2 各组软骨组织病理学变化比较 术后第12周，空白对照组股骨内髁关节软骨损伤处表现为软骨层广泛丢失或大量纤维化，被修复的组织表面不平整，缺损处由纤维肉芽组织填充，周围组织的细胞形态与正常关节软骨细胞差别较大，软骨细胞排列很不规律，大量细胞消失，过渡层及辐射层细胞非常少，细胞分层不明显，下潮线消失。结合物组膝关节股骨内髁软骨缺损处由类软骨组织修复，呈修复状态，被修复区域表面光滑，裂隙消失，修复区域的软骨细胞与正常关节软骨细胞相似，排列比较规律，结构清晰，下潮线基本恢复。透明质酸钠组关节软骨缺损处修复尚未平整，细胞形态与正常关节软骨细胞有区别，细胞数减少，部分有裂隙，排列不规则，下潮线难以观察。淫羊藿苷组缺损处细胞形态逐渐接近于正常软骨细胞，下潮线逐渐恢复，但修复情况差于结合物组。空白对照组、透明质酸钠组、淫羊藿苷组、结合物组HE染色组织学评分分别为(12.35±2.25)、(6.94±0.83)、(7.29±0.54)、(5.28±0.78)分，透明质酸钠组、淫羊藿苷组、结合物组HE染色组织学评分均低于空白对照组，结合物组HE染色组织学评分低于透明质酸钠组、淫羊藿苷组(P<0.05或<0.01)。

2.3 各组软骨组织Ⅱ型胶原表达比较 空白对照组、透明质酸钠组、淫羊藿苷组、结合物组软骨组织Ⅱ型胶原阳性表达率分别为(27.25±2.47)%、(32.63±1.94)%、(34.72±1.58)%、(37.67±1.25)%，组间两两比较差异均有统计学意义(P<0.05或<0.01)。

3 讨论

透明质酸是由N-乙酰葡萄糖醛酸反复交替而形成的一种高分子多糖体生物材料，是关节滑液的主要成分，也是软骨基质的成分之一[14]。透明质酸在关节腔内起润滑作用，可覆盖和保护关节软骨，改善关节挛缩，抑制软骨表面变性；透明质酸进入软骨基质后与糖蛋白形成聚合体，能修复损伤软骨，改善病理性关节液。淫羊藿苷为箭叶淫羊藿、柔毛淫羊藿、巫山淫羊藿、朝鲜淫羊藿等干燥茎叶提取物，呈淡黄色针状结晶粉末，能增加心脑血管血流量、促进造血功能、免疫功能及骨代谢，还具有补肾壮阳、抗衰老等功效[15]。另外淫羊藿苷还具有促进成骨细胞增殖及分化、抑制破骨细胞增殖与分化，提高软骨细胞代谢活性，促进软骨细胞增殖等作用。目前临床中透明质酸与淫羊藿苷的适应证及给药方式固定，但其对于骨科相关疾病只能对症治疗，可短期缓解症状，不能逆转疾病进展。

为提高透明质酸和淫羊藿苷对骨科疾病的治疗效果，扩大其应用范围，本研究突破传统中药的给药方式，提出将二者制备成结合物。本研究结果表明，淫羊藿苷与透明质酸可以通过化学偶联的方法结合，该结合物克服了单一药物治疗的局限性，扩大了淫羊藿苷的适用范围。本研究大体形态及ICRS评分结果显示，淫羊藿苷、透明质酸钠及二者的结合物均可保护膝关节软骨损伤兔的软骨组织，以淫羊藿苷与透明质酸结合物的效果最佳。本研究结果显示，空白对照组、透明质酸钠组、淫羊藿苷组、结合物组软骨组织Ⅱ型胶原阳性表达率依次升高，两组间比较均有统计学差异，表明淫羊藿苷与透明质酸结合物可促进软骨组织Ⅱ型胶原生成。分析原因，可能是透明质酸借助淫羊藿苷对软骨细胞的药理作用，增强其对软骨表面的覆盖和保护作用；淫羊藿苷作用于滑膜细胞，可促进自体高分子透明质酸的合成，从而达到营养软骨、润滑关节腔、缓解疼痛、改善患者日常活动及关节活动范围等目的。该结合物作用于软骨细胞，可增强软骨细胞活性，促进软骨细胞Ⅱ型胶原及黏多糖等活性物质的分泌，共同发挥营养、润滑、再生、功能重建等作用。

综上所述，本研究成功制备了淫羊藿苷与透明质酸的结合物，该结合物可提高膝关节软骨缺损兔软骨组织Ⅱ型胶原表达并发挥软骨保护作用。淫羊藿苷与透明质酸的结合物可扩大淫羊藿苷与透明质酸的应用范围，突破传统中药的给药方式，使药物直达病灶，迅速发挥作用，达到靶点治疗的效果。目前含中药成分的关节腔注射剂在临床上尚无报道，淫羊藿苷与透明质酸结合物的成功制备为关节内注射用中药的研究与开发奠定了基础。

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