响应面试验优化中式香肠天然复合抗氧化剂的配方

罗爱国，胡变芳

1(山西药科职业学院 食品工程系，山西 太原，030031) 2(晋中学院 生物科学与技术学院，山西 晋中，030619)

中式香肠是我国消费者最受欢迎的肉制品之一，但因其脂肪含量一般≥20%，易发生脂质过氧化产生异味而影响香肠品质及消费，尤其是在高温(45～60 ℃)干燥条件下[1-2]。在工业生产中主要通过添加合成抗氧化剂来减小脂质过氧化，以改善香肠品质以及延长货架期。随着越来越多消费者对合成抗氧化剂(如丁基羟基茴香醚、二丁基羟基甲苯等)安全问题的担忧，天然抗氧化剂替代合成抗氧化剂应用于食品工业已成为研究热点[3]。但单一的天然抗氧化剂的效果弱、效率低[4-5]，而抗氧化活性成分间复配的协同增效作用可有效提高抗氧化能力[6-7]。

花椒叶为芸香科植物花椒的叶子，富含蛋白质、碳水化合物、膳食纤维、维生素、矿物质等营养物质，是一种传统的纯天然食品[8]；且花椒叶含有抗氧化活性成分如黄酮、多酚、挥发油等[9-10]，LI等[11]发现花椒叶提取物可抑制腌制和干制银鲤腌的脂质氧化。前期我们的研究也证实了花椒叶提取物能够减缓食用油脂氧化，且与Vc具有协同增效作用[12]。花椒叶提取物具有抗氧化活性，能够用于食品保鲜。

迷迭香提取物、抗坏血酸(Vc)是我国肉制品中允许使用的天然抗氧化剂。关于花椒叶提取物与迷迭香的协同作用以及Vc、花椒叶提取物与迷迭香提取物三者复合抗氧化作用的研究均未见报道。

本研究主要采用Central Composite试验设计，以硫代巴比妥酸值(TBARS值)为响应值，考察了花椒叶提取物、迷迭香提取物以及Vc复合抗氧化剂在中式香肠中的保鲜效果，并优化复合抗氧化剂的配比，以期为中式香肠保鲜开发一种天然高效的食品抗氧化剂。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

花椒叶，采集于山西省阳泉市盂县；迷迭香提取物(质量分数：鼠尾草酚3.3%、鼠尾草酸5.3%、迷迭香酸5.5%)，南京泽朗医药公司；Vc(质量分数：99%)，东北制药集团股份有限公司；95%体积分数食用乙醇(食品级)，常州启迪化工有限公司；硫代巴比妥酸(TBA)，上海科丰化学试剂有限公司；1，1，3，3-四乙氧基丙烷(标准品)，武汉天植生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

电热恒温水浴锅(HH-2型)，常州国华电器有限公司；旋转蒸发器(RE-52AA型)，上海亚荣生化仪器厂；冷冻干燥机(FreeZone型)，美国Labconco公司；绞肉机(SZ-12型)，中国杭州赛旭食品机械有限公司；高速斩拌机(SZ-80型)，中国杭州赛旭食品机械有限公司；紫外可见分光光度计(TU-1810)，北京普板通用有限责任公司。

1.3 方法

1.3.1 花椒叶提取物的制备

采集的花椒叶用蒸馏水清洗后，经40 ℃真空干燥1 h，粉碎后过40目筛，经真空包装后4 ℃冷藏备用。花椒叶提取物的制备依据罗爱国等[12]方法，并稍作修改。 20 g花椒叶粉末与200 mL体积分数为65%食用乙醇溶液混合于圆底烧瓶，60 ℃回流提取10 min，经减压抽滤后得滤液；滤渣经100 mL的体积分数为65% 食用乙醇按上述方式再次回流提取，合并2次滤液得到花椒叶乙醇提取液。乙醇提取液在60 ℃下减压浓缩到约20 mL，经真空冷冻干燥(真空度10 Pa, 冷阱温度为-82 ℃)，得花椒叶提取物干粉(产率为84.5 mg/g)，经真空包装后4 ℃冷藏备用。

1.3.2 中式香肠的生产工艺

参照YU等[13]的工艺制作，新鲜无骨冷鲜猪肉(去皮、结缔组织、脂肪)和背脂分别被绞成5 mm肉末，根据表1配方制作香肠。香肠原材料被高速均质15 min，然后将香肠原料混合物分成若干份(约100 g/份)，分别将花椒叶提取物、迷迭香提取物及Vc按不同配比复合成抗氧化剂以随机方式添加到香肠原料混合物中，将混合物高速斩拌30 min后，灌入猪肠衣，隔3 cm刺孔放气，并结扎制成直径(35±2) mm、长约为15 cm的香肠。将制好的香肠在50 ℃中烘烤48 h，然后在15 ℃车间晾挂熟化20 d，经真空包装、贴标，在室温下贮藏。以未添加抗氧化剂的香肠为对照，在贮藏期取香肠样品测定硫代巴比妥酸值(TBARS)及进行感观评价。所有试验在不同的时间重复3次。

表1 中式香肠配方Table 1 Formulation of Chinese-style pork sausages

1.3.3 TBARS值测定

TBARS值采用赵建生等[14]的方法。取10.0 g香肠样品，加入50 mL三氯乙酸混合溶液，均质3 min，真空抽滤后，移取5.00 mL滤液于具塞比色管中，加入5 mL TBA溶液，在90 ℃水浴中加热40 min，冷却至室温后在12 000 r/min下离心5 min，取上清液加入5 mL三氯甲烷，摇匀，待静置分层后，用紫外分光光度计测定上清液在波长538 nm处的吸光度值，同时做空白试验。

用1，1，3，3-四乙氧基丙烷配制丙二醛标准溶液，按上述方法测定并绘制丙二醛标准曲线。

1.3.4 感观分析

感官分析采用ZHANG等[2]的方法。感官评定小组由10名食品专业的教师与学生组成，并在评价前根据我国肉制品感观评价标准(GB/T 22210—2008)进了专业培训。香肠样品经蒸煮15 min，取出冷却到温室，切成3 mm厚片，放在标有随机数字的白色磁盘中，感观评价在装有荧光灯的独立房间进行，每次测试时间相同。在评价不同样品之间，评价小组成员用温水漱口。评价方法采用9分制评分(评价标准见表2)，对香肠的感观品质(色泽、气味、滋味、质地及总体可接受性)进行评价。

表2 中式香肠感观评价标准Table 1 Standard of sensory evaluationof Chinese-style sausages

1.3.5 天然复合抗氧化剂配比优化试验

1.3.5.1 单因素试验

根据课题组前期研究[12]以及有关文献[11, 15-16]，单因素试验中花椒叶提取物、迷迭香提取及Vc用量分别选取0.08、0.07及0.60 g/kg。单因素试验按照1.3.2工艺制作中式香肠，测定香肠样品贮藏第60天的TBARS值，考察花椒叶提取物用量(0.00、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14、0.16 g/kg)、迷迭香提取物用量(0.00、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14 g/kg)及Vc用量(0.00、0.15、0.30、0.45、0.60、0.75、0.90、1.05、1.20 g/kg)对TBARS值的影响。

1.3.5.2 复合抗氧化剂配比响应面优化试验

在单因素考察试验结果的基础上，确定各抗氧化剂用量水平，采用Central Composite设计(CCD)试验方案，按照1.3.2工艺生产中式香肠，测定样品在贮藏第60天的TBARS值。对自变量A(花椒叶提取物用量)、B(迷迭香提取用量)及C(Vc用量)与响应值(TBARS值)关系进行二次多项式拟合回归，建立函数关系，确定复合抗氧化剂最佳配比。

1.3.6 天然复合抗氧化剂在中式香肠中效果测定

将优化的用量配制复合抗氧化剂，按照1.3.2工艺制作中式香肠，分别在贮藏第0、15、30、45、60、75、90、105、120天取样测定TBARS值，并评价贮藏第60天的香肠感观品质。

1.3.7 统计方法

所有实验重复3次。实验结果以±SE形式表示。配方优化采用Design-Expert 8.06软件进行试验设计及回归分析，并求极值。数据采用SPSS 18.0软件进行方差分析，香肠的TBARS值及感观评价用邓肯多重比较来确定不同处理间的显著性差异，以p≤0.05作为显著性水平，以p≤0.01作为极显著性水平；复合抗氧化剂配方验证分析采用一般线性模型(GLM)，将处理和时间作为固定效应，重复作为随机效应，进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 花椒叶提取物用量对中式香肠TBARS值的影响

固定迷迭香提取物用量为0.07 g/kg、Vc用量为0.60 g/kg，考察花椒叶提取物用量对中式香肠的TBARS值的影响，如图1所示。

图1 花椒叶提取物用量对中式香肠TBARS值的影响Fig.1 Effect of extract from Zanthoxylum bungeanum Maxim leaves on TBARS of Chinese-style sausage

由图1可知，随着花椒叶提取物用量的增加中式香肠的TBARS值逐渐降低。当花椒叶提取物用量增加至0.08 g/kg时，香肠TBARS值为0.65 mgMDA/kg；当用量继续增加(≥0.10 g/kg)，相对应的香肠TBARS值间无显著性差异(p>0.05)。因此，确定花椒叶提取物最佳用量为0.08 g/kg，将此用量作为Central Composite试验设计中该因素的零水平。

2.1.2 迷迭香提取物用量对中式香肠TBARS值的影响

固定花椒叶提取物用量为0.08 g/kg、Vc用量为0.6 g/kg，考察迷迭香提取物用量对中式香肠的TBARS值的影响，如图2所示。

图2 迷迭香提取物用量对中式香肠TBARS值的影响Fig.2 Effect of Rosemary extract on TBARS of Chinese- style sausage

由图2可知，迷迭香提取物用量增加至0.06 g/kg时，香肠TBARS值为0.61 mg MDA/kg；当其用量继续增加(≥0.08 g/kg)，相对应的香肠TBARS值间无显著性差异(p>0.05)。因此，确定花椒叶提取物最佳用量为0.06 g/kg，将此用量作为Central Composite试验设计中该因素的零水平。

2.1.3 Vc用量对中式香肠TBARS值的影响

固定花椒叶提取物用量0.08 g/kg、迷迭香提取物用量0.07 g/kg，考察Vc用量对中式香肠的TBARS值的影响，如图3所示。

图3 Vc用量对中式香肠TBARS值的影响Fig.3 Effect of Vc on TBARS of Chinese-style sausage

由图3可知，Vc用量增加0.45 g/kg时，香肠TBARS值为0.62 mgMDA/kg；当其用量继续增加(≥0.60 g/kg)，相对应的香肠TBARS值间无显著性差异(p>0.05)。因此，确定Vc最佳用量为0.60 g/kg，将此用量作为Central Composite试验设计中该因素的零水平。

2.2 天然复合抗氧化剂配比响应面优化

2.2.1 CCD试验设计方案及试验结果

根据单因素考察试验结果，确定花椒叶提取用量的零水平为0.8 g/kg，标准差为0.4；迷迭香提取物用量的零水平为0.6 g/kg，标准差为0.3；Vc用量的零水平为0.45 g/kg，标准差为0.2。抗氧化剂各因素用量范围实际值及标准化值见表3。通过CCD试验设计模型，采用响应面法对复合抗氧化剂配比进行优化，试验方案及结果见表4。

表3 抗氧化剂各因素用量范围实际值及标准化值Table 3 The dosage range actual value of various factorsfor antioxidants and standardized value

注：A为花椒叶提取物用量；B为迷迭香提取物用量；C为Vc用量。

表4 复合抗氧化剂配比优化的响应面试验设计及结果Table 4 Experimental design and result of the responsesurface analysis of composite antioxidant ratio optimization

注：A为花椒叶提取物用量；B为迷迭香提取物用量；C为Vc用量；Y为TBARS值。

2.2.2 回归模型建立及方差分析

对响应面试验结果进行回归拟合，得到了贮藏期中式香肠的TBARS值与各抗氧化剂用量的回归方程：Y=0.42+0.032A+0.044B-0.023C+0.005AB-0.044AC+0.034BC+0.051A2+0.044B2+0.023C2；式中，A为花椒叶提取物用量，g/kg；B为迷迭香提取物用量，g/kg；C为Vc用量，g/kg。并对回归方程进行了方差分析，结果见表5。模型项p≤0.000 1，说明回归方程的关系是显著的；失拟项p>0.05，失拟项不显著，说明该回归模型拟合良好，可用该模型对试验结果进行统计分析；调整回归系数为R2=0.942 1，表明拟合的回归方程能较好地反映各抗氧化剂用量与中式香肠的TBARS值之间的实际变化关系，可用来代替试验真实点预测响应值。

3个因素中一次项A、B、C，二次项A2、B2、C2以及交互项AC、BC对响应值影响极显著，AB项对响应值影响不显著(p≤0.05)。这表明花椒叶提取物、迷迭香提取物及Vc用量均显著影响贮藏期中式香肠的TBARS值，由各因素的F值可知，其对TBARS值影响的主次顺序为：B>A>C，即迷迭香用量>花椒叶提取物用量>Vc用量；花椒叶提取物与Vc、迷迭香提取物与Vc之间均存在显著的协同增效作用，但花椒叶提取物与迷迭香提取物间无显著增效作用，其影响的主次顺序为：花椒叶提取物用量×Vc用量>迷迭香提取物用量×Vc用量。

表5 响应曲面二次回归模型的方差分析Table 5 Variance analysis of response surface quadraticregression model

2.2.3 因素间的交互效应分析

为进一步考察因素间的交互效应，对有关变量经降维处理(分别将回归方程中C、B和A项固定在零水平)，得回归方程下如：YAB=0.42+0.032A+0.044B+0.005AB+0.051A2+0.044B2；YAC=0.42+0.032A-0.023C-0.044AC+0.051A2+0.023C2；YBC=0.42+0.044B-0.023C+0.034BC+0.044B2+0.023C2，图4为相对应的响应面和等高线图。响应面曲线越陡峭，表明该因素对响应值影响越大[17]，等高线图越呈椭圆形，表明两因素间的交互效应越大[16]。从图4(a1、b1及c1)的响应面图可直观看出各因素对中式香肠TBARS值的影响大小，迷迭香提取物用量的影响最大，其次是花椒叶提取物，Vc的影响最小。这与回归分析结果一致。

图4-b2中，花椒叶提取物用量和Vc用量交互效应的等高线呈椭圆，说明两因素间存在明显的交互效应，花椒叶提取物用量为0.073 g/kg和Vc用量为0.52 g/kg时，TBARS值最小。图4-c2中，迷迭香提取物用量和Vc用量交互效应的等高线趋近椭圆，说明两因素间存在交互效应，迷迭香提取物用量为0.034 g/kg和Vc用量为0.65 g/kg时，TBARS值最小；图4-a2花椒叶提取物用量和迷迭香提取物用量交互效应的等高线图近似圆形，说明两因素间不存在显著的交互效应。可见花椒叶提取物与Vc、迷迭香提取物与Vc对中式香肠抗氧化作用具有明显的增效作用。

图4 各因素交互作用对中式香肠TBARS值影响的响应面及等高线图Fig.4 Response surface and contour plots shows the interactive effect of three factors on TBARS of Chinese-style sausage

2.2.4 复合抗氧化剂配比优化及效果验证

采用Design Expert 8.0软件对回归函数模型进行极值分析，预测模型响应值(TBARS)，优化得三因素最佳组合为Z(-0.01，-0.47，0.17)，即花椒叶提取物用量为0.079 2 g/kg、迷迭香提取物用量为0.045 9 g/kg、Vc用量为0.484 g/kg，此时中式香肠样品的TBARS最小值Y为0.398 1 mg MDA/kg。按此最优配比进行3次重复试验验证，测得中式香肠贮藏60 d的实际TBARS平均值为0.403 7 mg MDA/kg，与预测值接近程度达98.61%，表明该回归模型能够准确预测在中式香肠中复合抗氧化剂配比情况。

2.3 复合抗氧化剂在中式香肠中的抗氧化效果

2.3.1 香肠TBARS值的变化

香肠在较高的贮藏温度、较多的脂肪含量、光线以及体系中的促氧化成分(如调味料、活泼金属离子等)存在下极易发生脂质氧化。TBARS值被广泛用来衡量肉制品脂质氧化的程度，TBA反应物的存在是由于脂质的过氧化物在自氧化第二阶段被氧化成醛、酮等，其中丙二醛为主要产物之一[18]。在本研究中复合抗氧化剂对中式香肠贮藏期TBARS值的影响见图5。在贮藏前，对照组香肠的TBARS值为0.39 mgMDA/kg，这个值接近于YU等[13]报道的0.35 mgMDA/kg，在贮藏120 d后增加到3.38 mg MDA/kg；而添加复合抗氧化剂的中式香肠在各个测定时间点上TBARS值均显著低于对照组(p≤0.05)。中式香肠TBARS值在贮藏期的增加表明脂质过氧化的发生，而花椒叶复合抗氧化剂的添加能够显著延缓中式香肠的脂质氧化。在相似的研究中，殷燕等[15]发现在猪肉饼中添加不同剂量(0.03%、0.06%和0.09%)的迷迭香提取物，其抗脂肪氧化效果显著高于对照组(p<0.05)，效果与添加0.02%的二丁基羟基甲苯相当；顾仁勇等[16]证实了Vc(添加量0.36 g/kg)与植酸等复配添加到湘西香肠具有显著的抗氧化性，与对照组相比有较低的POV值和TBARS值。SOJIC等[19]认为当肉制品的TBARS值> 1 mg MDA/kg时开始腐败，在本研究中对照组香肠TBARS值在贮藏30 d 达到0.93 mg MDA/kg；而处理组的TBARS值为0.20 mg MDA/kg，直到第75天达到1.05 mg MDA/kg。据FAN等[20]报道肉制品的TBARS限值是2 mg MDA/kg，在本试验中添加复合抗氧化剂香肠在贮藏期120 d的TBARS值(1.72 mg MDA/kg)均小于2 mg MDA/kg，而对照组香肠在贮藏60 d的TBARS值达到了2.44 mg MDA/kg。这些结果均表明，复合添加剂在中式香肠中具有显著的抗氧化效果，能够延长香肠的货架期45 d以上。

图5 复合抗氧化剂对中式香肠贮藏期的TBARS值的影响Fig.5 Effect of composite antioxidant on TBARS value of Chinese-style sausage during storage

2.3.2 香肠感观品质评价

感观分析结果见表6，添加了花椒叶提取物复合抗氧化剂中式香肠在贮藏60 d的感观属性(色泽、气味、滋味、质地及总体可接受性)显著低于对照组(p≤0.001)。由2.3.1结果可知，对照组香肠在贮藏60 d时，其TBARS值为2.44 mg MDA/kg，且各感观指标均表明香肠已经腐败，故未作滋味评价。对照组香肠各感观属性值为4.11～4.27，表明香肠已不能被消费者接受；而添加复合抗氧化剂中式香肠感观属性值在6.45～6.83，各感观属性值均显著高于对照组(p≤0.001)，受消费者喜爱。感观评价结果表明复合抗氧化剂香肠处理组具有更好的感观品质，与香肠的TBARS值研究结果总体一致。

表6 复合抗氧化剂对中式香肠贮藏第60天的感观品质的影响Table 6 Effect of composite antioxidant on sensory quality of Chinese-style sausage on the 60 day

注：a-b表示同一列中的不同处理间的显著性不同(p<0.05)；ND为未检测。

3 结论

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