超声处理对鹰嘴豆蛋白乳化性的影响

刘昕，金明良，覃小丽，钟金锋

(西南大学 食品科学学院，食品科学与工程国家级实验教学示范中心，重庆，400715)

鹰嘴豆(又称桃尔豆、鸡心豆)，是一类营养价值较高的豆类植物。它含有丰富的皂苷、异黄酮等营养成分，具有降血压血脂、延缓女性衰老的作用[1]，是一种广受消费者喜爱的食品原料。鹰嘴豆中蛋白质含量高于28%[1]，其蛋白质易于消化，具有的8种人体必需氨基酸含量优于燕麦，是一类优质的蛋白来源[1]。随着人们对膳食健康食品的需求增加和重视，对鹰嘴豆蛋白功能特性的影响因素进行研究，有助于开发利用鹰嘴豆相关资源(如：鹰嘴豆植物蛋白饮品)。

目前鹰嘴豆蛋白的研究主要集中在其分离纯化[2-3]，鹰嘴豆功能性肽的制备[4]，以及鹰嘴豆蛋白的性能表征[3]。研究显示，在低离子强度下，鹰嘴豆蛋白有较低的溶解性和乳化性[5]，改善鹰嘴豆蛋白的乳化性有助于拓展其在食品体系中的应用。顾楠等[6]采取不同方法(如：超声波、超高压等物理方法，酶法、化学法)处理鹰嘴豆蛋白，在一定程度上提高其性能。然而，关于处理条件(如：超声时间、功率)对鹰嘴豆蛋白乳化性影响程度尚不清楚；另外，环境因素(温度、pH值等)对经处理后的鹰嘴豆蛋白的乳化性质的影响也有待研究。因此，本文将研究超声处理条件(超声功率和时间)对鹰嘴豆蛋白乳化性的影响，并同时分析超声处理后鹰嘴豆蛋白乳化性质在环境因素(pH和温度)影响下的变化规律，以期为改善鹰嘴豆蛋白乳化性和开发相关产品提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鹰嘴豆，乌鲁木齐市广泰峰糖酒有限公司；石油醚(沸程30～60 ℃)、乙醇、NaOH、NaCl、HCl：分析纯；超纯水，Milli-Q超纯水系统(美国Millipore公司)制备；大豆油，中粮福临门食品营销有限公司。

1.2 实验仪器

BJ-300型粉碎机，德清拜杰电器有限公司；JY98-IIIDN型超声细胞粉碎仪(探头直径20 mm)，宁波新芝生物科技股份有限公司；RW20数显型混合顶置式机械搅拌器，德国IKA公司；DF-101S型水浴锅，河南巩义予华仪器有限公司；FD-1A-50型冷冻干燥机，北京博医康实验仪器有限公司；AXTG-16G型离心机，常州安信仪器设备有限公司；雷磁pHS-3C酸度计，上海仪电科学仪器股份有限公司；DHG-9140A电热恒温鼓风干燥箱，上海齐欣科学仪器有限公司；T6新世纪紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司。

1.3 实验方法

1.3.1 鹰嘴豆蛋白的提取

室温下纯水浸泡鹰嘴豆12 h，将其去皮后置于烘箱干燥(50 ℃，48 h)，再将去皮鹰嘴豆粉碎成鹰嘴豆粉。采用石油醚对鹰嘴豆粉进行脱脂(V石油醚∶V豆粉=2∶1，30 ℃下机械搅拌(500 r/min)60 min)，待豆粉自然沉降后倾出溶剂(上层)，继续用石油醚对该物料(下层)进行脱脂。然后，在50 ℃干燥条件下对已分离有机溶剂的物料进一步脱除残留的有机溶剂，挥干溶剂后所得的物料称为脱脂鹰嘴豆粉。采用碱溶酸沉法提取鹰嘴豆蛋白[7]，并稍作改进。将脱脂鹰嘴豆粉与水混合[1∶10(g∶mL)]，用NaOH溶液(2 mol/L)调pH至9.0，室温下机械搅拌(500 r/min)3 h后离心(5 000 r/min，7 min)，收集含蛋白质的上清液。将沉淀与水以1∶5的比例混合，重复上述步骤2次。将所有上清液混合后用HCl(0.1 mol/L)调pH至4.5后离心(8 000 r/min，20 min)。收集沉淀后进行冷冻干燥，获得鹰嘴豆蛋白。将鹰嘴豆蛋白置于干燥器密封保存，用于后续实验。

1.3.2 鹰嘴豆蛋白的超声处理

将鹰嘴豆蛋白制成60 g/L的溶液，在超声过程中通过冰浴进行控温(< 49 ℃)，采用不同超声功率(204、396、600 W)和超声时间(10、15、30 min)处理鹰嘴豆蛋白。将超声处理的蛋白溶液进行冷冻干燥。以蛋白的氮溶指数(nitrogen solubility index，NSI)、持油性以及乳化稳定性(emulsification stability index，ESI)指标，评价不同条件超声处理对鹰嘴豆蛋白乳化性的影响[8-9]。

1.3.3 鹰嘴豆蛋白的乳化性评价

1.3.3.1 鹰嘴豆蛋白NSI的测定

分别称取0.5 g超声处理前、后的鹰嘴豆蛋白，溶于30 mL水中，用0.1 mol/L的HCl溶液或0.1 mol/L的NaOH溶液调节pH为7.0，定容至50 mL，室温搅拌30 min后，离心(4 200 r/min，20 min)，将上清液转移至50 mL容量瓶，定容，最后取5 mL样液用分光光度法测定上清液中蛋白质含量，用凯氏定氮法测定鹰嘴豆蛋白质含量，按照公式(1)计算NSI[10-11]。

(1)

1.3.3.2 鹰嘴豆蛋白持油性的测定

分别称取超声处理前、后的鹰嘴豆蛋白样品(0.25 g，记为m1)于15 mL离心管中，加入1.5 mL大豆油(质量记为m2)，搅拌1 min后静置30 min，离心(3 500 r/min，25 min)后取出游离油，称量游离油的质量(m3)，按照公式(2)计算鹰嘴豆蛋白的持油性[11]。

(2)

1.3.3.3 鹰嘴豆蛋白ESI的测定

分别将超声处理前、后的鹰嘴豆蛋白样品制成2 g/L样品溶液(用10 mmol/L pH 7.0磷酸盐缓冲溶液作溶剂)，调节样品溶液至不同pH值(3、4、5、7、9)，在不同温度(20、30、40、60、70 ℃)条件下搅拌3 h，加10 mL大豆油，均质(10 000 r/min，1 min)，分别取均质后(0和10 min)样液50 μL，用1 g/L SDS溶液稀释100倍，测定500 nm处的吸光度，以SDS溶液为空白[3]。按照公式(3)计算鹰嘴豆蛋白的ESI[12]。

(3)

式中：A0，均质后0 min乳液的吸光度；A10，均质后乳液静置10 min后的吸光度。

1.4 数据处理

每个实验至少重复2次，每个样品的各指标测定至少平行测定3次，结果以平均值±标准偏差表示。采用SPSS 18.0中的Duncan′s test检验进行组间均值显著性分析(p<0.05被认为有显著差异)，用Origin 8.0作图表。

2 结果与分析

2.1 超声处理对鹰嘴豆蛋白NSI的影响

蛋白质的溶解度与其乳化性呈正相关，溶解度越高的蛋白质，乳化性能越优[3]。在本实验中，通过测定NSI来评价鹰嘴豆蛋白溶解度。在中等超声功率(396 W)情况下，考察超声时间对鹰嘴豆蛋白NSI的影响。由图1可知，NSI随着超声时间的延长呈现先增加后减小的趋势。在本实验条件下，延长超声时间显著提高鹰嘴豆蛋白NSI。当超声时间为15 min时，鹰嘴豆蛋白的NSI达到最高，说明此时蛋白的溶解度最高，其NSI比超声处理前的提高了16%。

在超声时间为15 min时，超声功率对鹰嘴豆蛋白NSI的影响如图2所示。随着超声功率的增加，鹰嘴豆蛋白的NSI呈现先增加后减小的趋势。当超声功率为396 W时，鹰嘴豆蛋白的NSI达到最大值。

鹰嘴豆蛋白的NSI在一定的超声功率和时间范围内显著提高并达到最大值，这意味着一定的超声处理条件利于提高鹰嘴豆蛋白的溶解度(图1、图2)，这与孙英杰的研究结果是一致的。孙英杰研究显示大豆蛋白溶解度和活性巯基量均随超声时间的增加而呈先增加后减小的趋势，这可能是因为超声波的空化作用破坏了蛋白质内部的二硫键，蛋白质分子展开，溶解度增加[13-14]。毕爽等研究显示黑豆蛋白巯基量随超声功率的增加呈现先增加后减小的趋势[15]，这主要由于超声处理破坏了蛋白质二硫键，使其转化成巯基；而超声功率对黑豆蛋白巯基量与NSI的影响规律是一致的，进一步提示了适当超声处理后蛋白NSI的提高与蛋白质的二硫键破坏有关。此外，超声波会使蛋白质形成非共价键分子，与水的结合能力增强，溶解度提高[13-14]。当提高超声功率(>396 W)和延长时间(>15 min)时，鹰嘴豆蛋白的NSI有降低趋势，这主要由于蛋白质在过高功率或过长时间超声处理下变性程度加剧，蛋白质凝集，分子表面亲水基团减少，溶解度降低[13]。

图2 超声功率对鹰嘴豆蛋白NSI的影响Fig.2 Effect of ultrasonic power on solubility of chickpea protein注：不同小写字母(a、b)代表NSI的显著性差异。

2.2 超声波处理对鹰嘴豆蛋白持油性的影响

持油性表示蛋白质吸附脂质的能力，持油性越强，蛋白质与脂质结合能力越强。本实验中，通过测定持油性来评价鹰嘴豆蛋白持油能力。在中等超声功率(396 W)情况下，考察超声时间对鹰嘴豆蛋白持油性的影响，如图3所示。在15 min内，持油性随着超声时间的延长呈现快速增大的趋势；在15 min之后，持油性则趋于稳定。当超声时间达到15 min时，持油性达到2.13 g/g，此时蛋白的持油性能优异，其持油性是未超声处理的1.6倍。

图3 超声时间对鹰嘴豆蛋白持油性的影响Fig.3 Effect of ultrasonic time on oil-holding capacity of chickpea protein注：不同小写字母代表持油性的显著性差异。

在超声时间为15 min时，超声功率对鹰嘴豆蛋白持油性的影响如图4所示。由图4可知，持油性随着超声功率的提高先增加后减小。当超声功率在204～396 W之间时，鹰嘴豆蛋白持油性较大(约2.1 g/g)，其持油性是未超声处理的1.6倍。

图4 超声功率对鹰嘴豆蛋白持油性的影响Fig.4 Effect of ultrasonic power on oil-holding capacity of chickpea protein注：不同小写字母代表持油性的显著性差异。

鹰嘴豆蛋白的持油性在一定的超声功率和时间范围内显著提高并达到最大值(图3、图4)，这主要是因为超声波促使蛋白质分子结构疏松，蛋白质内部疏水结构暴露，分子更易与脂质结合[14]，持油性能增强。当延长时间(15～30 min)，鹰嘴豆蛋白持油性趋于稳定，这可能由于在中等功率(396 W)下延长时间的不足以使蛋白质未发生严重变性。随着超声功率的提高(>396 W)，持油性呈现下降趋势，这主要是因为蛋白质的变性程度增加，聚集情况严重，持油性下降[16]。

2.3 pH对超声波处理后的鹰嘴豆蛋白ESI的影响

ESI表示乳液保持稳定状态的能力，ESI越高，表示乳化性质越优，在本实验中，用ESI评价鹰嘴豆蛋白的乳化性。pH对经不同超声功率处理的鹰嘴豆蛋白ESI的影响结果如图5所示。经处理的鹰嘴豆蛋白的ESI明显高于未经处理蛋白的ESI，这与杨勇等人的研究结果是一致的。杨勇等研究结果显示超声处理会显著增加蛋白质乳化性(超声功率400 W，时间30 min，ESI提高2.3%左右)，进一步通过红外光谱分析发现该超声条件处理后的绿豆蛋白β-转角结构明显增加了6.44%，此结构的增加使得蛋白质变得疏松，进而使得绿豆蛋白的ESI明显高于未经处理蛋白的ESI[17]。经过超声处理的鹰嘴豆蛋白ESI随pH的变化趋势与未经处理的类似，204 W和396 W超声处理的鹰嘴豆蛋白的ESI接近，且高于经高等超声功率(600 W)处理的鹰嘴豆蛋白的ESI。此外，结合对溶解度与持油性的研究结果(图2和图4)，超声功率为396 W时，鹰嘴豆蛋白性质较优异，因此选择396 W超声功率处理鹰嘴豆蛋白，接着研究pH对不同超声时间处理的鹰嘴豆蛋白ESI的影响。

图5 在不同pH条件下，超声功率对鹰嘴豆蛋白ESI的影响Fig.5 Effects of ultrasonic power on chickpea protein ESI at different pH注：同组处理条件中不同字母和数字代表超声处理蛋白ESI的显著性差异。

当超声功率为396 W时，pH对经不同超声时间处理的鹰嘴豆蛋白ESI的影响结果如图6所示。由图6可知，在pH为5、7时，经不同时间超声处理的鹰嘴豆蛋白ESI差异不显著，而在其余pH值时，ESI随着超声时间的增加先增加后减小，当超声时间为15 min时，ESI最高。ESI随着超声功率增大以及超声时间的延长先增大后减小(图5和图6)，这主要是由于当蛋白质受到高等功率或长时间超声处理时，蛋白质变性严重，乳化性变差，ESI下降[14]。

图6 在不同pH条件下，超声时间对鹰嘴豆蛋白ESI的影响Fig.6 Effects of ultrasonic time on chickpea protein ESI at different pH注：同组处理条件中不同字母和数字代表超声处理蛋白ESI的显著性差异。

由图5、图6可知，鹰嘴豆蛋白ESI先呈下降趋势(pH<4)，之后ESI随pH增加呈现先增大后减小的趋势(pH>4)。ESI在pH为4～5时较低，这主要由于此时的pH接近鹰嘴豆蛋白的等电点[3]，蛋白质发生静电屏蔽作用，不溶性蛋白增加。综上所述，适当的超声处理可以提高鹰嘴豆蛋白的ESI。当鹰嘴豆蛋白处于等电点附近时，ESI会达到最低值。

2.4 温度对超声处理后的鹰嘴豆蛋白ESI的影响

超声时间为10 min时，经不同超声功率处理的鹰嘴豆蛋白ESI随温度变化趋势如图7所示。

图7 在不同温度条件下，超声功率对鹰嘴豆蛋白ESI的影响Fig.7 Effects of ultrasonic power on chickpea protein ESI at different temperature注：同组处理条件中不同字母和数字代表超声处理蛋白ESI的显著性差异。

由图7可知，在20 ℃条件下，经超声处理的鹰嘴豆蛋白ESI明显高于未处理蛋白质ESI，这主要因为超声处理增加了疏水肽的数量，使得蛋白更易形成胶束，乳化性变优，ESI升高[12]。经204 W超声功率处理的鹰嘴豆蛋白质在30、40和60 ℃下，与未经处理的鹰嘴豆蛋白ESI无显著性差异，这可能是由于超声功率太小且超声时间太短，蛋白质变性程度相差微小导致的。但在部分温度的条件下，ESI随超声功率的增加(396～600 W)呈现增大的趋势(30、60 ℃)，这主要因为超声功率的增加促进了蛋白质的变性，疏水肽数量增加，乳化性变优[12]。而70 ℃条件下，随着超声功率的增加，鹰嘴豆蛋白ESI处于先增后减的状态，这可能是由于超声和温度的累积作用下，蛋白质变性严重，分子聚集，乳化性变差，ESI下降。由于在所考察温度下600 W超声处理鹰嘴豆蛋白的ESI较高，因此选择超声功率为600 W处理鹰嘴豆蛋白，并考察该处理蛋白在不同温度下ESI的变化情况。

当超声功率为600 W时，经不同超声时间处理的鹰嘴豆蛋白ESI随pH变化趋势如图8所示。由图8可知，在20 ℃条件下，超声10 min以及15 min的鹰嘴豆蛋白ESI显著高于未经超声处理的，而随着时间的继续延长(30 min)，ESI明显减小。这主要是由于超声时间的增加加剧蛋白质变性程度，蛋白质分子聚集严重，溶解度下降，乳化性质变差，ESI减小[14]。

据图7、图8中未经超声处理蛋白的ESI变化趋势线可知，当温度小于40 ℃时，不同温度下ESI无显著性差异(p>0.05)。当温度大于40 ℃，ESI随温度升高先增大后减小。当温度处于50～60 ℃之间时，ESI较高。这主要是因为鹰嘴豆蛋白在40～55 ℃时其溶解度较高(约为80%)[3]，进而提高了其ESI。随着温度的持续升高，由于分子二级、三级结构破坏，蛋白质发生聚集作用，乳化性减小，ESI下降[18]。但由图7、图8中超声处理的蛋白质ESI的趋势可发现，在20～40 ℃时，ESI呈下降趋势，这可能是由于超声促使蛋白质变性，分子结构改变，随着温度的增加，蛋白质氢键减少，持水力下降[18]，蛋白质乳化性质变低。在较高温度条件下(30～70 ℃)，未经超声处理以及经10 min超声时间处理的鹰嘴豆蛋白ESI的最高值在60 ℃，而经15 min以及30 min超声时间处理的鹰嘴豆蛋白ESI最高值则是在40 ℃。这可能因为温度以及超声处理的双重作用，使得蛋白质在超声时间增加的条件下，临界变性温度减小。综上所述，由于温度促使鹰嘴豆蛋白变性的原因，ESI随温度的增加先增大后减小。

3 结论

在一定超声功率(≤396 W)以及一定超声时间(≤15 min)范围内，由于超声波使鹰嘴豆蛋白发生轻微变性，使得蛋白结构疏松，疏水肽数量增加，从而使鹰嘴豆蛋白溶解度(提高16%)、持油性(提高1.6倍)以及乳化稳定性都有提升。但过高功率或长时间超声处理会使蛋白质变性严重，分子聚集，从而使得蛋白质溶解度、持油性以及乳化稳定性都不再上升甚至下降。在蛋白质等电点附近(pH 4～5)时，由于蛋白质呈电中性乳化稳定性最低。在高温下(40～70 ℃)，由于蛋白质变性乳化稳定性随着温度增加先上升后下降。

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