稀酸和蒸汽爆破预处理玉米秸秆对琥珀酸发酵的影响

谢慧,张东,张兆昆,王石磊,毛国涛,王风芹,宋安东*

1(河南农业大学 生命科学学院，农业部农业微生物酶工程重点实验室,河南 郑州，450002) 2(郑州市质量技术监督检验测试中心，河南 郑州，450006)

木质纤维素类生物质资源包括农业生产的废弃物和剩余物(如农作物秸秆、谷壳、麸皮、蔗渣等)、林木(软木和硬木)及林业加工废弃物、草类等，是地球上最丰富的可再生资源[1]。目前，我国每年秸秆资源量约为9亿t，潜力巨大，其中仅玉米秸秆就有近4.11亿t，占全部秸秆量的43.07%[2-3]。玉米秸秆的主要有机成分包括纤维素、半纤维素和木质素，经过化学、生物或物理法预处理，酶解糖化生成葡萄糖，木糖、阿拉伯糖、半乳糖等，而这些糖可进一步用来生产燃料乙醇、木糖醇、有机酸、单细胞蛋白、糠醛、乙酰丙酸等工业产品[4]。

琥珀酸又名丁二酸，是一种重要的C4平台化合物，常用于作为合成通用化学品的起始原料，在化工、食品、医药、农药等领域有广泛的应用前景[5]，被美国能源部列为最具潜力的平台产品之一[6]。目前，合成琥珀酸的方法主要有化学合成法、生物转化法以及微生物发酵法，但由于微生物发酵法具有原料成本低、反应条件温和等优点，因此，微生物发酵法成为近年来合成琥珀酸的一个重要方法[7]。而以可再生生物质资源为原料，利用微生物发酵生产琥珀酸，不仅可以节约大量的化石资源，而且生产过程相对无污染，对于缓解环境污染具有积极的意义。ZHENG等[8]对玉米秸秆、小麦秸秆和水稻秸秆3种生物质资源在碱预处理条件下生产琥珀酸进行了研究，结果表明玉米秸秆水解液更有利于厌氧发酵产琥珀酸，琥珀酸质量浓度可达到53.2 g/L。LI等[9]对玉米秸秆和棉秆预处理后水解液生产琥珀酸进行了研究，其中以玉米秸秆水解液为碳源时，琥珀酸产量可达到15.8 g/L。产琥珀酸放线杆菌(ActinobacillussuccinogenesATCC 55618)是1株兼性厌氧菌，能利用多种碳源且在生产琥珀酸时能够利用CO2作为碳源，发酵性能良好[10]，不仅具有较好的工业前景，而且可以一定程度上缓解地球温室效应。

本课题以玉米秸秆为原料，研究了稀酸预处理(AT)和蒸汽爆破预处理(SE)技术对酶解糖化过程的影响，并以二者预处理水解液为碳源，利用产琥珀酸放线杆菌发酵生产琥珀酸，为微生物工业化生产琥珀酸奠定了理论基础。

1 材料与方法

1.1 原料处理及酶解条件

玉米秸秆：取自河南省新乡市，粉碎至10目，含水率约为7.48%。

取上述玉米秸秆进行蒸汽爆破预处理，预处理条件为：蒸汽压力2.0 MPa、保压时间150 s，所用设备为河南正道启宝环保科技有限公司研发的工艺试验台(QBS-80B型)。将蒸汽爆破后的玉米秸秆75 ℃烘干至恒重备用。

将蒸汽爆破预处理过的干玉米秸秆置于300 mL三角瓶中，加蒸馏水至固液比1∶8(g∶mL)并用10 mmol/L NaOH调节pH至(4.8±0.2)，每克干物料分别添加纤维素酶和木聚糖酶20 FPU /g和200 U/g，于48 ℃、150 r/min糖化144 h，每12 h补加1次预处理物料并补加1次酶，共补加4次。最后，过滤并收集滤液。

称取20 g已粉碎的未处理秸秆，按照固液比1∶8(g∶mL)加入1%的稀硫酸于300 mL三角瓶中，于灭菌锅中121 ℃预处理1 h。冷却至室温后按照以上的酶解条件进行处理。

1.2 菌株

产琥珀酸放线杆菌(Actinobacillussuccinogenes)，保存号ATCC 55618，中国工业菌种保藏中心。

1.3 糖化液过柱处理

用D301弱碱性阴离子交换树脂100 g上柱，以10滴/min的流速将玉米秸秆水解液经过离子交换柱，并收集液体取样，检测处理前和处理后糖的含量从而计算糖的损失、抑制物的浓度。

1.4 培养基

(1)琥珀酸放线杆菌种子培养基(g/L)：葡萄糖2.5、K2HPO4·3H2O 2.5、胰蛋白胨17、大豆蛋白胨3、NaCl 5、pH 7.5加水定容至1 L。

(2)发酵培养基(g/L)：玉米秸秆水解液 60、酵母粉 12、玉米浆15、K2HPO43、KH2PO43、NaCl 1、MgCl20.4、CaCl20.4、MgCO340。

1.5 培养方法

将处于生长对数期的种子液以10%的接种量，接入装有50 mL培养基的250 mL厌氧甁中，再充入300 mL CO2气体，并用封口膜密封。为了利于传质，将厌氧瓶置于37 ℃摇床中180 r/min发酵培养。取发酵液在室温下10 000 r/min离心10 min，取上清于-20 ℃留存待测。

1.6 检测方法

利用高效液相色谱(HPLC，Diodex P680)检测发酵产物及糖化液。水解糖利用示差检测器(RI-101，Shodex)检测；有机酸用紫外检测器检测，波长为210 nm；色谱柱为AminexHPX-87H(300 mm×7.8 mm)；流动相为5 mmol/L H2SO4，流速0.6 mL/min，进样量20 μL，柱温55 ℃。

琥珀酸产率(%)定义为：每消耗1 g糖所产生琥珀酸的质量(g)。

2 结果与分析

2.1 基于两种预处理条件水解液成分分析

受木质素这种难降解高聚物的包裹和纤维素本身的高度结晶、难溶性的影响，天然状态下的木质纤维素水解率很低，必须通过预处理技术破坏木质素的结构、降低纤维素聚合度、增加纤维素的孔隙率和结构松散度，增加酶对纤维素的可及性，使原料组分结构发生变化，从而有利于后续的酶解糖化[11]。对玉米秸秆进行稀酸预处理(AT)和蒸汽爆破预处理(SE)后其组分变化见表1。

表1 不同处理物料的纤维素、半纤维素和木质素含量及降解率Table 1 Content of cellulose, hemicellulose and lignin of corn stalk after different pretreatments

玉米秸秆经过稀酸预处理后，纤维素、半纤维素和木质素含量均下降，其中半纤维素的降解率最高，达到55.25%，纤维素降解率为14.44%，木质素降解率为8.57%。而经过蒸汽爆破的玉米秸秆半纤维素降解率最高可达87.97%，远远高于稀酸预处理，木质素降解率为25.31%，而纤维素降解率较低，只有7.92%。因此，与稀酸预处理相比，蒸汽爆破预处理可更加完整地保留纤维素，且最大程度地破坏了玉米秸秆中半纤维素与木质素。陈洪章等[12]认为，蒸汽爆破预处理分为高温蒸煮和瞬时减压两个过程，两者共同破坏秸秆的结构，爆破力使木质素重新分布，纤维素充分暴露，极大地增加了秸秆的表面积和孔隙度，因此酶解效率提高，结果见表2。

经蒸汽爆破预处理后酶解糖化液中，葡萄糖与木糖2种组分得率相差较大，比例约为4∶1，而稀酸预处理组的葡萄糖与木糖得率之比仅为2∶1，这是由于蒸汽爆破后的半纤维素降解过多所致。且蒸汽爆破组的糖化率比酸预处理组高，达到11.78%，总糖质量浓度比稀酸预处理组的糖浓度高出31.62 g/L，表明蒸汽爆破预处理技术更适合于获取高浓度的糖。马斌等[13]人对采用4种不同预处理方式处理的玉米秸秆水解液成分进行分析，其结果与本实验的结果相似。这也充分说明了爆破预处理相对于稀酸预处理更为激烈，纤维素、半纤维素和木质素破坏严重，从而使得酶解后水解液中发酵抑制物浓度较高，最为明显的是蒸汽爆破组的糠醛质量浓度为1.17 g/L，是稀酸预处理组0.84 g/L的1.39倍，对应的5-HMF为2.14 g/L，是稀酸处理的0.58 g/L的3.69倍，而蒸汽爆破组甲酸为4.21 g/L是稀酸组0.61 g/L的6.9倍、乙酸为7.06 g/L是稀酸组的2.67倍，总酚类物质质量浓度都较低，分别为63.69 mg/L和41.35 mg/L。从表2可知，对于有毒物质的去除用水洗及D301处理效果显著，因此蒸汽爆破预处理后直接糖化所得的糖化液中发酵抑制物较多，不利于发酵，需要做脱毒处理。

表2 两种预处理方法酶解后玉米秸秆水解液的组分Table 2 The composition of different pretreatment corn stalk after enzymolysis

注：a:稀酸预处理过的秸秆；b:蒸汽爆破预处理后经水洗烘干后的秸秆；c:b中所过滤出的水；d:蒸汽爆破预处理秸秆

2.2 基于2种预处理技术不同糖浓度对琥珀酸发酵的影响

糖浓度对菌体的生长及代谢有重要影响，琥珀酸等有机酸均由糖经过代谢转化而成。由图1可知当糖质量浓度在90 g/L以上，会抑制菌体生长及代谢，这使得糖浓度成为影响琥珀酸产量的主要因素，可能原因是高浓度糖会形成较高的渗透压，从而抑制菌体生长，导致菌体代谢生长受到影响[14]，同时对于高浓度的秸秆水解糖液中含有较高的发酵抑制物如糠醛、酚类物质等，从而抑制菌体的生长；而较低的糖质量浓度琥珀酸产量较低，不利于后期分离浓缩。在80 g/L的起始糖质量浓度条件下，AT组拥有最高的琥珀酸产量，达到28.12 g/L，但其副产物如乙酸等也大量生成，将会不利于后续工艺的开发。LIU等[15]已证明间歇性补充糖能够有效降低抑制物浓度，从而减缓高糖质量浓度对细胞生长的抑制作用。因此，综合考虑残糖浓度和琥珀酸产量，选定60 g/L的初始糖质量浓度进行后续发酵试验。

图1 不同预处理的初始糖质量浓度对发酵的影响Fig.1 Comparison of products formation at different initial concentrations of reducing sugar with different pretreatment

2.2.1 两种不同预处理技术对琥珀酸发酵的影响

初始糖质量浓度为60 g/L，研究两种预处理技术对琥珀酸发酵的影响。如图2所示，SE组未能产生琥珀酸，主要是发酵培养基中较多的发酵抑制物影响了菌体的生长及代谢[16]。AT组和SE-1组的琥珀酸产量分别为22.69 g/L和25.32 g/L，比纯糖组分别降低32.69 %和24.89 %。值得注意的是AT组的甲酸和乙酸产量较高，分别达到19.4 g/L和13.49 g/L，而其余组甲酸和乙酸含量均较低。可能原因是由于酸预处理过程中产生的某些物质改变了碳代谢流向而引起琥珀酸产量降低[17]；或者木糖和葡萄糖比例不同也会影响代谢流向[18]，促进副产物的累积却抑制了琥珀酸产生；再或者高浓度的硫酸盐会严重抑制菌体的生长并导致琥珀酸产量降低[19]。其次发现除了SE组外，纯糖组的残糖高于另外2组，此结果是由于纯糖发酵产酸量较大，使得发酵液pH降低不利于细胞的生长导致[20]。因此以秸秆水解液作为碳源发酵生产琥珀酸过程中，由于糠醛、HMF等发酵抑制物的含量较高，从而抑制了菌体生长及琥珀酸的产生。

SE-1-汽爆后水洗酶解获得的糖液，SE为汽爆后直接糖化(下同)图2 两种预处理作用下的发酵结果对比Fig.2 The comparison of two kinds of pretreatment for the fermentation results

2.2.2 D301树脂脱毒处理对琥珀酸发酵的影响

从表2可知，经D301树脂脱毒处理后的发酵液成分发生了较大变化，糠醛、总酚脱除效果明显，脱除率几乎达到100%，并且其他抑制成分也都有所减少。但同时经过脱毒处理也损失了一部分糖，其中稀酸组的葡萄糖损失了32.22%，而另外2组的葡萄糖损失率较低，仅为20.52%，这可能是由于稀酸组中的抑制物相对较少引起的。有研究表明水洗也能去除有毒物质且效果明显[21]，本实验采用水洗浸泡的方式也取得了较好的效果。

SE-T表示SE糖化液用D301树脂脱毒处理；SE-1-T表示水洗SE糖化液用D301树脂脱毒处理；AT-T表示稀酸糖化液用D301树脂脱毒处理图3 D301树脂处理对琥珀酸发酵的影响Fig.3 The influence of D301 resin processing for succinic acid fermentation

从图2和图3分析中发现，原本的SE糖化液不能用于发酵，但经D301树脂处理后可以进行发酵，且琥珀酸产量为11.79 g/L。而经水洗和D301树脂结合处理组的琥珀酸产量为24.97 g/L，与仅水洗处理组的琥珀酸产量相产不大，因此仅用水洗方式脱毒就已能够到达相同的效果。然而稀酸处理组与D301树脂处理的稀酸组的琥珀酸产量相比，两者相差不大。

综上所述，产琥珀酸放线杆菌能够耐受一定浓度的有毒物质，如糠醛、酚类物质等。但从未来工业化的角度考虑，AT组的副产物含量较高，琥珀酸产量相对较少，这些都将不利于后续琥珀酸提纯[22]，SE-1组的副产物量较低，琥珀酸产量相对较高，因此蒸汽爆破预处理技术更有利于琥珀酸的工业化应用。

2.2.3 几种有毒物质处理对琥珀酸发酵的影响

根据文献报道，在琥珀酸发酵过程中，糠醛质量浓度超过1.5 g/L时琥珀酸的产生就会停止，而HMF质量浓度超过1 g/L时就会停止发酵[23]。从表2可以看出，秸秆水解液中含有大量的甲酸、乙酸、糠醛和HMF，其中甲酸和乙酸同时又是琥珀酸放线杆菌的代谢产物，采用在纯糖培养基中添加不同浓度的抑制物，考察它们对琥珀酸产量的影响，结果见图4。

图4 有机酸和醛类物质对琥珀酸发酵的影响Fig.4 The influence of organic acids and aldehydes for succinic acid fermentation

如图4-A所示，随甲酸浓度的增加，琥珀酸产量没有太大的变化，而乙酸呈现出增长的趋势。但当甲酸质量浓度高于4 g/L 时，琥珀酸产生受到抑制，培养基中添加4 g/L的甲酸钠时，琥珀酸产量与对照组相比下降了9.32%。而随着培养基中甲酸钠添加量的增加，甲酸的生成量反而减小，乙酸的生成量增加，当甲酸钠添加量为4 g/L时，与对照组相比甲酸的产生量降低了53.62%，乙酸的生成量增加了23.17%。从图4-B可知随着乙酸添加量增加到10 g/L以上时，琥珀酸产量明显降低；达到在20 g/L时，琥珀酸含量与对照组相比下降了68.30%，而在5 g/L以内对琥珀酸产量基本没有影响。因此在秸秆水解液存在少量的甲酸或乙酸不会对琥珀酸的产量产生很大的影响，文献中也报道过在培养基配方中添加有1 g/L的乙酸钠[24]，对产物产量影响不大。如图4-C所示，随着糠醛浓度的提高，琥珀酸的产量呈现下降趋势，当糠醛添加量为1.2 g/L时，与对照组相比琥珀酸产量下降了64.67%，当糠醛质量浓度增加到1.5 g/L时，琥珀酸发酵停止，与文献报道报道结果一致，然而当糠醛浓度低于0.6 g/L时对琥珀酸的产量影响不大。从4-D中可知，随HMF添加量的增加，琥珀酸产量随之降低，高于1.2 g/L时，发酵停止。当添加量为0.9 g/L时，琥珀酸产量降低了64.44%。由此可知HMF在相同浓度下对琥珀酸发酵的抑制作用强于糠醛，但低于0.3 g/L的质量浓度时不会对琥珀酸发酵产生影响。

3 结论

本研究通过对酸处理和蒸汽爆破预处理进行对比分析，结果表明蒸汽爆破预处理的秸秆更有利于酶解，其还原糖质量浓度最高可达到147.24 g/L，比稀酸预处理的115.61 g/L高出11.78%。利用D301树脂处理各种不同预处理方式下的抑制物，结果表明，蒸汽爆破组仅用水洗处理的发酵琥珀酸产量就能达到25.32 g/L，此条件对发酵抑制物的去除效果已较为明显，从而节省了脱毒处理的工业成本。产琥珀酸放线杆菌对水洗汽爆玉米秸秆水解液中的有毒物质具有较好的耐受性，并且发酵效果良好，在起始糖质量浓度为60 g/L时，琥珀酸产量最终为25.32 g/L，产率达42.2%，与纯糖发酵相比仅降低了24.92%。

4 讨论

目前利用纤维水解液进行琥珀酸发酵的研究一般都只集中在化学预处理，即酸和碱预处理。经过预处理后的秸秆进行酶解时需要大量的酸碱来中和，造成硫酸盐浓度过高，不利于Actinobacillussucinogenes的生长[18]，这与当前的环保需求不符且后期的糖化效果较差。近年来蒸汽爆破预处理技术快速发展，因其处理后的秸秆更易酶解，并且具有成本低、能耗少、无污染等优点而备受青睐。

无论哪种预处理方式最终都会产生或多或少的抑制物，因此需进一步的脱毒处理。甲酸和乙酸作为菌体的代谢产物，在纯糖培养基中添加这2种物质，高质量浓度的甲酸和乙酸，即甲酸和乙酸质量浓度分别大于6 g/L和10 g/L时会影响琥珀酸的发酵，因此需要筛选出甲酸和乙酸生成量较少的菌株。糠醛和HMF对琥珀酸发酵的影响较大，因此需要对预处理秸秆进行处理才能使用，但本实验所用菌株对糠醛和HMF有一定的耐受浓度，分别为0.9 g/L和0.6 g/L。本研究仅用水洗就可达到一定的脱毒效果，且对于本实验琥珀酸的发酵影响不是很大，这不仅节约脱毒的成本，且对设备要求简单，无复杂的操作过程，能够更好地用于大规模的工业化生产。

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