高效液相色谱-可变波长检测法用于上清丸的质量标准提高

周远雄 陈繁华

1.广东省梅州市第二中医医院，广东梅州 514071；2.广东省梅州市食品药品监督检验所，广东梅州 514071

上清丸是广东联康制药有限公司的一个主打产品，药品批准文号为国药准字Z44022090-44022091，主要由菊花、薄荷、栀子、黄芩（酒炒）、黄柏（酒炒）、大黄（酒炒）等中药组成的大蜜丸。功能主治清热散风，解毒，通便，用于头晕耳鸣，目赤，鼻窦炎，口舌生疮，牙龈肿痛，大便秘结，日常深受人们的欢迎。由于各种客观原因，原质量标准[1]仅收载了传统显微鉴别方法，查阅文献发现有测定上清丸的连翘苷含量[2]、黄芩苷含量[3],并无同时测定君药菊花中的绿原酸及黄芩中的黄芩苷。为了更好地提高药品内在质量，现拟对该制剂进行质量评价和标准提高研究。本文采用高效液相色谱-可变波长检测法增订绿原酸及黄芩苷的含量同时测定方法，能够进一步快速提高上清丸的质量，确保临床应用的科学安全有效可控性。

1 仪器和试药

1.1 仪器

Agilent1100高效液相色谱仪（四元低压梯度泵、真空脱气机，安捷伦公司）；岛津电子分析天平AUW220D（岛津公司）；KQ-250DE数控超声仪（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试药

绿原酸对照品（批号：110753-201415，含量为96.2%）、黄芩苷对照品（批号：110715-201619，含量为93.5%）均由中国食品药品检定研究院提供；上清丸（广东联康制药有限公司，批号为：160402、160601、170501）；各阴性制剂均由广东联康制药有限公司生产提供；乙腈为色谱级；乙醇等其余试剂为分析纯；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为CAPCELL PAK C18(资生堂）（250×4.6mm，5µm）。 以 乙 腈（A）-0.5% 磷 酸溶液（B）为流动相进行梯度洗脱（0-～10min，15%A；10 ～ 15min，40%A；25 ～ 30min，40%A；30～ 32min，15%A），流 速 1.0mL/min，检 测 波 长（0～ 10min：327nm；10～ 30min：274nm）柱 温30.0℃；进样体积10µL。绿原酸及黄芩苷主峰与相邻峰分离良好，理论板数均能达到4000以上。

2.2 对照品溶液的制备

称取绿原酸对照品0.01574g，黄芩苷对照品0.01338g置250mL容量瓶中，加稀乙醇稀释至刻度，摇匀，即得。

2.3 供试品溶液的制备

取本品大蜜丸，剪碎，混匀，取约0.5g精密称定，精密加入稀乙醇25mL，称定重量，超声处理20分钟（功率 250W，频率 32KHz），取出，放冷，再称定重量，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，进样前用0.45µm微孔滤膜滤过，即得。

2.4 专属性试验

按处方及工艺制备不含菊花和黄芩的阴性样品，再按照“2.3”项制备阴性对照液。结果显示阴性无干扰，见图1。

2.5 线性关系试验

分别精密吸取“2.2”项下的混合对照品溶液2µL、5µL、10µL、20µL 和 30µL 进样。记录峰面积，以绿原酸、黄芩苷的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标进行线性回归，分别得方程Y=2.63589X+1.26902（r=0.9999）；Y=14.76628X+0.16393（r=0.9999）， 表明绿原酸在12.1135～181.7025µg/mL的浓度范围内线性关系良好；黄芩苷在10.0082～150.1236µg/mL的浓度范围内线性关系良好。

2.6 精密度试验

取同一批号样品6份，按“2.3”项下方法制备，测定，结果RSD为0.97%（n=6）。

2.7 稳定性试验

精密吸取供试品溶液 10µL，分别于 0、2、4、8、12、24h进样，结果绿原酸峰面积的RSD为0.93%，黄芩苷的RSD为0.78%。表明供试品溶液在24h内基本稳定。

图1 HPLC色谱图（327nm，274nm）

2.8 加样回收率试验

取样品（批号为160601），剪碎混匀，精密称取6份，每份0.25g，置具塞锥形瓶中，加入等量的对照品，按“2.3”项下提取方法制备成供试品溶液，进样分析，见表1。

2.9 样品含有量测定

取 3批 样 品（批 号 分 别 为 160402、160601、170501）按“2.3”项下方法制备成供试品溶液，测定，计算含量，见表2。

3 讨论

3.1 成分的选择

君药菊花的有效成分为绿原酸和黄酮类，绿原酸已被证明具有抗菌、抗炎作用、抗疲劳、降血脂和免疫调节作用等[4-5]。而黄芩含有黄芩苷、黄芩苷元、汉黄芩素等，其中黄芩苷是其主要活性成分，具有抗肿瘤、抗炎、抗过敏等作用[6-8]，因此选择绿原酸和黄芩苷进行含量考察。

3.2 检测波长的选择

参考相关文献[9-16]绿原酸在327nm处有最大吸收而黄芩苷则在274nm处有最大吸收，两者在碳十八色谱柱上的保留时间相差亦较大，为节省分析时间，采用梯度洗脱并可变波长检测的方法能够很好分离。

表1 加样回收率试验结果（n=6）

表2 含有量测定结果（mg/g）

3.3 提取参数的选择

绿原酸是由咖啡酸与奎尼酸形成的酯，其分子结构中有酯键、不饱和双键及多元酚，其可利用乙醇、丙酮、甲醇等极性溶剂提取出来。黄芩苷是从黄芩根中提取分离出来的一种黄酮类化合物，难溶于有机溶剂，考虑选择毒性很小的稀乙醇作为提取溶剂。提取方法有加热回流法、超声处理法和浸渍法等，由于加热回流法效率比超声法低，而浸渍法耗时长，因此选择了超声处理方法，经方法学考察选择的提取参数能最大限度提取出目标成分。

3.4 流动相的选择

本文曾经参考药典，选择“甲醇-水-冰醋酸（55：45：1）”和“乙腈 -0.5% 磷酸溶液（9：91）”作为流动相。绿原酸可以有效分离，但是黄芩苷和相邻的色谱峰不能完全分离。经试验，用本文中的梯度洗脱可以达到系统适用性的要求。

本文用于检测绿原酸和黄芩苷的含量，分离好专属性强，结果准确可信度高，精密度和线性关系均良好，可用上清丸的质量标准控制。

[1] 国家药典委员会.《卫生部药品标准中药成方制剂第十册》[S].北京：人民卫生出版社，1995：8.

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[3] 肖燕.上清丸质量标准的研究[J].中国民族民间医药，2008，23（8）：35-37.

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[9] 师永清，康淑荷，王爱军.HPLC法同时测定黄连双清丸中栀子苷、芍药苷、黄芩苷、盐酸小檗碱和大黄素的含量 [J].药物分析杂志，2013，33（9）：1612-1614.

[10] 孙承浩，王吉华.HPLC同时分析穹菊上清丸中7个化学成分的含量研究[J].中国生化药物杂志，2014，34（7）：177-179.

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[13] 黄燕萍，黄焜.HPLC法同时测定栀子金花丸中栀子苷和黄芩苷的含量 [J].中国药事，2010，24（10）：1002-1004.

[14] 刘冰，王蓉华，徐永波.HPLC法同时测定银黄胶囊中绿原酸、黄芩苷含量 [J].中国药事，2006，20（5）：303-304.

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[16] 国家药典委员会.《中国药典》一部[S].北京：中国医药科技出版社，2015：301、310.