HPLC测定养阴生津片中丹皮酚和五味子醇甲的含量

蔡勇科 张火旺 邱治汉 黄秀琴

1.广东省河源市中医院，广东河源 517000；2.广东省河源市药品药检所，广东河源 517000

养阴生津片由地黄、黄芪、牡丹皮、五味子、枸杞子、黄连、石斛、红参、石膏、麦冬、山药、茯苓等13味中药组成，具有滋补肾阴，生津止渴，益气降糖等作用[1-3]。临床主要用于成年人非胰岛素依赖性轻型、中型糖尿病。在现行药物标准[4]中，养阴生津片中仅有定性检测，河源市科技局项目，项目编号：2016-56，养阴生津片质量标准研究中，只是研究黄芪甲苷含量测定，而对其他成分的含量测定少有提及，从而很难有明确证据确定药剂质量及药物的安全性能[5]。本项目除研究黄芪甲苷含量外，再后续研究牡丹皮和五味子，丹皮酚及五味子醇甲是分别来自牡丹皮及五味子中的有效成分，是养阴生津片发挥药效的重要成分[6-7]。因此选取此两种成分作为含量测定实验目标，拟采用高效液相色谱法（HPLC）建立测定模型并实施含量测定，本试验的液相条件简单快速，分离度好，为有效进行该产品的质量控制提供了很好的实验依据。具体报道如下。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

岛津LC-2010AHT（日本岛津）高效液相色谱仪，CP225D型多功能电子分析天平，SB2200超声处理器（上海科导超声清洗仪有限公司）。

1.2 试剂

乙腈（色谱纯，TEDIA），磷酸（广州市番禺力强化工厂生产，分析纯），超纯水；丹皮酚对照品（购自中国食品药品检定研究院，110708-201407）；五味子醇甲对照品（购自中国食品药品检定研究院，110857-201714）；养阴生津片（市中医院提供3批次，批号分别为：20170801，20170901，20170902）。

2 方法

2.1 相关溶液的配制方法

丹皮酚对照品储备溶液的配制：以电子天平称取丹皮酚对照品10.12mg于100mL容量量瓶中，然后以50%甲醇溶液溶解至刻度并充分混匀即得。五味子醇甲对照品储备溶液的配制：以分析天平准确称取10.05mg五味子醇甲对照品，并置于100mL量瓶中，以50%浓度甲醇溶液溶解充分混匀并加量至刻度即得。对照品溶液的配制：以量筒分别精确量取上述配制好的两种储备溶液各5.0mL置于25mL量瓶中，同样以50%浓度甲醇溶液混匀后加至刻度，分别以0.45µm滤膜滤过即可。待检样品溶液的配制：分别取3批次待检养阴生津片样品20片，人工去除药片表面糖衣，用研钵研碎，以分析天平分别精确称取1.0g置于具塞锥形瓶，加入50%甲醇溶液50.00mL后闭塞，称重，然后以16KHZ，296W超声处理30min后自然冷却，再次称重，比较两次重量的差距，以50%甲醇液补充至超声处理前重量，充分搅匀后滤过，取出续滤液，于0.45µm微孔滤膜上过滤，即得样品。阴性对照液的配制：按质量标准中规定的处方比例同法配制不含牡丹皮、五味子的阴性样品，按样品液配制方法法配制成相应的阴性对照液。

2.2 色谱条件及进样分析

Hypersil C18（250mm×4.6mm，5µm）填充柱，流动相为乙腈-0.1 %磷酸溶液（B），时间浓度梯度洗脱设置为：30%A（0min）、45%A（15min）、50%A（30min）、30%A（35min）；检测波长为 260nm，流速为1.0mL/min，进样量为20µL，柱温25℃；以峰面积外标法定量。在本色谱条件下，养阴生津片中丹皮酚及五味子醇甲的色谱峰与其他组分峰均取得较好分离，干扰性较小。

3 结果

3.1 干扰测试结果

分别量取上述配置好的丹皮酚及五味子醇甲对照品溶液、待检样品溶液及阴性对照液，在上述既定色谱条件下进样，并进行HPLC测绘出相应图谱，结果显示丹皮酚及五味子醇甲两组分的峰值出现时间区域内无其他干扰峰波，表明样品中其他成分均对样品测定无明显干扰。见图1。

3.2 线性关系的考察

分别精密量取丹皮酚及五味子醇甲对照品储备液 5、10、15、20、25、30µL 置于量瓶中，通过甲醇定容至要求刻度，充分摇匀后得到一系列标准溶液。在上述色谱条件下分别进样20µL，进行峰面积的测定，以峰面积（A）为纵坐标，对照品浓度（C）为横坐标绘制标准曲线，进行线性回归，计算得回归方程。丹皮酚A=134040C+18016（r=0.9996），五味子醇甲A=216687C-26165（r=0.9992），结果表明丹皮酚溶液浓度在0.5060～3.0360µg，五味子醇甲溶液浓度在0.1005～0.6030µg范围内均与各自峰面积线性关系良好。

3.3 HPLC测定方法特性分析

取同一对照品溶液连续重复进样6次，进样量20µL，测定峰面积，计算RSD分别为RSD（丹皮酚）=0.8%（n=6），RSD（五味子醇甲）=0.9%（n=6），结果表明该方法使用的仪器具有良好精密度；取同一批号供试品，精密称取6份，按样品测定方法平行测定含量，丹皮酚的RSD为1.05%（n=6），五味子醇甲的RSD=1.10%（n=6），结果表明该方法重复性好；取同一样品溶液，在室温放置，每隔2 h测定一次，连续测定6次，结果丹皮酚的RSD为1.07%（n=6），五味子醇甲的RSD=1.15%（n=6），说明样品溶液在12 h内测定，结果稳定性良好。

3.4 加样回收率试验结果

精密称取已知丹皮酚及五味子醇甲含量的适量样品（20170801，丹皮酚含量：0.335mg/g，五味子醇甲含量：0.141mg/g）至具塞锥形瓶中，共6份，分别加入上述丹皮酚及五味子醇甲对照品储备液（其中丹皮酚储备液3.00mL与五味子醇甲储备液10.00mL，置于25mL量瓶中，用甲醇溶液溶解至刻度，作为混合对照品溶液，丹皮酚浓度为0.0607mg/mL、五味子醇甲浓度为 0.0402mg/mL）1mL，2mL，3mL，密塞，称定重量，超声处理（16KHz，296W）30min，自然冷却后再次称重，两次称重的差距以50%甲醇补充，充分摇匀后滤过，取过滤液，用微孔滤膜（0.45µm）再次过滤即得。分别量取以上6份溶液20µL，注入液相色谱议进行测定并计算丹皮酚及五味子醇甲的回收率。见表1。

3.5 养阴生津片样品中丹皮酚及五味子醇甲含量测定

取不同时间生产的三批养阴生津片进行丹皮酚及五味子醇甲含量的测定，按2.1方法进行配制待测样品液，进样20µL，记录峰面积，按外标法计算丹皮酚及五味子醇甲含量。根据三批样品所测丹皮酚及五味子醇甲含量结果，暂定养阴生津片中丹皮酚含量定量限为0.3mg/g，五味子醇甲含量定量限为0.1mg/g。见表2。

表1 养阴生津片回收率试验结果

表2 3批样品含量测定结果（n=3）

4 讨论

养阴生津片是目前临床应用较广泛的一类中成药物，可养阴益气，清热活血，降糖补肾，主要用于非胰岛素依赖性的轻中度糖尿病的治疗[8-9]。牡丹皮和五味子是其发挥作用的重要组分，其中牡丹皮具有清热凉血、活血清热的功用，五味子则具有益气生津、补肾降糖的作用，能明显改善糖尿病患者肾阴虚、高血糖症状[10-11]。而丹皮酚及五味子醇甲分别是牡丹皮和五味子中的活性成分，因此，本文选取养阴生津片中丹皮酚及五味子醇甲含量的测定来评估药物药效具有很强的说服力[12-13]。

高效液相色谱法（HPLC）在选择检测波长时，测试结果发现，波长设置为260nm时，丹皮酚及五味子醇甲的吸收率均达最大，测量的灵敏度较高，此外，设置此长度波长时，色谱峰对称分布，干扰小，效果佳，故选择260nm作为最终样品的检测波长[14]。提取方法的选择 以乙腈-水-磷酸、乙腈-水、甲醇-水、甲醇-乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸等不同流动相进行研究，结果以乙腈-0.1%磷酸溶液作为流动相，两种成分分离较好。分别通过超声处理样品 10min，20min，30min，40min 四个时间跨度，最终测得样品的含量最高的为超声处理30min和40min组，故认为在超声30min基本提取完全，故最终选用甲醇超声处理30min[15-16]。

本试验以高效液相色谱法（HPLC）法测定养阴生津片中丹皮酚及五味子醇甲含量，通过测试，最终确定以260nm为检测波长，50%甲醇为提取液，提取时间设置为30min，可获得精确、可重复和稳定的测定结果。该法操作较为便捷，样品回收率高，稳定性高，重复性好，是养阴生津片质量控制的有效方法，因此本法的建立有利于更好地控制产品质量。

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