陆地棉脱水素基因GhDHN1与拟南芥AtCOR47基因的比较

王俊娟，陆许可，郭丽雪，阴祖军，王德龙，陈修贵，王帅，樊伟丽，陈超，叶武威

（中国农业科学院棉花研究所/棉花生物学国家重点实验室/农业部棉花生物学与遗传育种重点实验室，河南安阳455000）

脱水素（DHNs）属于 LEA 蛋白（Late embryogenesis abundant protein，胚胎发育晚期丰富蛋白）家族中的第二类[1]。脱水素基因受干旱、低温、高盐等逆境诱导，在植物响应非生物胁迫和适应性调控中起着重要作用[2]。

Gilmour等[3]克隆了拟南芥基因AtCOR47，属于脱水素基因。Welin等[4]进一步研究表明，At-COR47是1个低温响应基因，同时响应脱落酸（Abscisic acid，ABA）和干旱胁迫。 前期研究中，我们克隆了陆地棉的脱水素基因GhDHN1[5]，试验结果显示，GhDHN1响应低温胁迫，在细胞膜附近发挥作用，与拟南芥脱水素基因AtCOR47有相似的功能。比较基因组学在后基因组时代是1门重要的工具学科。通过不同物种间的基因组序列比较，可以在功能基因组学的研究中将发挥重要作用[6]。本研究将棉花脱水素基因与模式植物拟南芥的脱水素基因进行比较，对他们的基因结构、蛋白质特性、蛋白质基序以及基因功能等方面进行系统分析，为研究GhDHN1基因的功能、物种的进化关系奠定基础，为进一步研究棉花脱水素基因GhDHN1的应用提供有用信息。

1 材料与方法

1.1 供试数据库和基因

陆地棉基因组数据库（http://cgp.genomics.org.cn/page/species/index.jsp）[7]和拟南芥数据库（http://www.arabidopsis.org/）。供试基因：陆地棉脱水素基因GhDHN1[5]，在陆地棉数据库中编号为CotAD_58358；拟南芥脱水素基因AtCOR47[3-4]，在拟南芥数据库中编号为At1g20440。

1.2 方法

1.2.1脱水素基因GhDHN1和AtCOR47启动子、DNA序列和CDS序列的获得。在NCBI上下载最新的BLAST程序包，将BLAST本地化[8]，同时将GhDHN1和AtCOR47基因所需数据本地化。利用王俊娟等[5,9]报道的GhDHN1以及陆地棉数据库中DNA序列位置，将GhDHN1基因的启动子、DNA序列、CDS调取出来；依据拟南芥数据库中脱水素基因（At1g20440）的信息将拟南芥脱水素基因At-COR47的启动子、DNA序列、CDS调取出来。

1.2.2染色体定位。将GhDHN1、AtCOR47的DNA序列分别与陆地棉和拟南芥的基因组数据进行比对，分别获得GhDHN1、AtCOR47在染色体上的位置。

1.2.3脱水素GhDHN1、AtCOR47基因结构分析。利用在线软件 Gene Structure Display Server（GSDS2.0，http://gsds.cbi.pku.edu.cn/）[10]将GhDHN1 和AtCOR47的CDS与其对应的DNA序列进行比对，确定GhDHN1的外显子/内含子结构，确定内含子的位置。

1.2.4脱水素GhDHN1、AtCOR47所编码蛋白的性质分析。利用ProtParam在线程序（http://web.expasy.org/protparam/）对 GhDHN1、AtCOR47 蛋白质性质进行分析。

1.2.5脱水素GhDHN1、AtCOR47同源性比较。利用在线分析工具EMBOSS Water（https://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/）分析GhDHN1 和AtCOR47的DNA序列、CDS、内含子以及其编码蛋白质的一致性和相似性，参数设置为：空位罚分（Gap_penalty）为 10、延伸罚分（Extend_penalty）为 0.5。

1.2.6脱水素GhDHN1、AtCOR47内含子比较。利用DNAMAN 6.0软件计算GhDHN1和AtCOR47基因的DNA序列和内含子中AT含量。

1.2.7GhDHN1和AtCOR47的启动子中顺式作用元件分析。利用植物顺式作用元件数据库P1antCARE在线启动子预测工具（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/） 预 测GhDHN1和的AtCOR47启动子和内含子中的顺式调控元件。

2 结果与分析

2.1 GhDHN1和AtCOR47基因染色体定位以及基因结构分析

染色体定位结果表明，GhDHN1位于陆地棉D亚组第9号染色体，DNA序列为726 bp。基因结构分析表明，GhDHN1的DNA序列含有1个长度为90 bp的内含子，2个外显子长度分别为258 bp和378 bp；AtCOR47位于拟南芥1号染色体上，DNA序列为943 bp，含有1个145 bp的内含子，2个外显子长度分别为339 bp和459 bp（表1）。

表1 GhDHN1和AtCOR47基因的分子特征

图1显示，AtCOR47的DNA序列长于GhDHN1的DNA序列，内含子和外显子均长于GhDHN1的外显子长度；这两个基因的第2个外显子均长于第1个外显子。GhDHN1定位于细胞膜附近[5]，AtCOR47定位于细胞质、细胞膜和细胞核中。

图1 GhDHN1和AtCOR47基因的内含子-外显子结构分析

2.2 GhDHN1和AtCOR47蛋白性质及同源性比较

由表2可以看出，GhDHN1和AtCOR47蛋白均为酸性，带负电荷，属于亲水性蛋白质。AtCOR47的酸性强于GhDHN1，亲水性也略高于GhDHN1。

利用在线分析工具EMBOSS Water分析两基因以相关序列的同源性，结果表明，GhDHN1和AtCOR47的DNA序列、CDS、蛋白质序列和内含子序列的一致性分别为 53.80%、56.80%、45.2%、42.7%（表 3）。

2.3 GhDHN1和AtCOR47基因所编码的蛋白质结构域分析

GhDHN1与AtCOR47基因所编码的蛋白质均属于SKn型脱水素，但不同的是GhDHN1的N段含有 1个S片段，C段含有2个K片段[9]，而 At-COR47的N段含有1个S片段，C段含有3个K片段[4]，比GhDHN1蛋白多了1个K片段。

2.4 GhDHN1和AtCOR47基因内含子比较

利用 DNANMAN 6.0软件，GhDHN1基因DNA序列中AT碱基含量占52.62%，内含子序列中AT碱基含量占63.33%；而AtCOR47 DNA序列中AT碱基含量占54.61%，内含子序列中AT碱基含量占75.86%。2个基因的外显子和内含子的剪接方式类似，均符合GT-AG规则。内含子均位于编码S片段的核苷酸之间。

表2 GhDHN1和AtCOR47蛋白质性质比较

2.5 GhDHN1和AtCOR47基因启动子中顺式作用元件比较

GhDHN1和AtCOR47基因的启动子中均含有参与非生物逆境胁迫响应的顺式作用元件包括：无氧诱导必需顺式作用调控元件、高温胁迫响应顺式作用元件、低温响应顺式作元件、参与干旱诱导的MYB结合位点，说明两个基因在响应非生物逆境胁迫功能上极为相似，但AtCOR47基因中无参与保卫与胁迫响应顺式作用元件 （TC-rich repeats），推测GhDHN1拥有AtCOR47不具有的独特抗逆功能。GhDHN1和AtCOR47基因的启动子中均参与激素响应的顺式作用元件包括：脱落酸响应元件、赤霉素响应元件、赤霉素响应元件、水杨酸响应元件，而AtCOR47基因的启动子中含有2个GhDHN1启动子中没有的乙烯响应元件。

3 讨论与结论

脱水素的结构是其行使功能的前提条件。K片段是脱水素的特征结构域[11]，K片段富含赖氨酸，其所形成的双亲性螺旋与部分变性蛋白的疏水位点相结合，起到类似于分子伴侶的作用[12]。Reyes等[13]研究表明，K片段是脱水素起冷冻保护作用的基本结构。Lin等[14]研究表明COR47作为低温保护剂可能帮助植物忍受与冷冻相关的脱水逆境；Puhakainen等[15]转基因试验表明，在拟南芥中过表达AtCOR47等脱水素基因时，低温胁迫后在转基因体内积累了大量的脱水素，与对照相比，转基因植株在受到冷冻时 （－10℃）表现出较低的LT50值（Lethal temperature of 50%，半致死温度）和较高的存活率。同时证明了AtCOR47提高植株的抗冻性部分原因是由于AtCOR47对细胞膜所起的保护作用。而GhDHN1基因在仅响应4℃度低温胁迫[5]，这也许与AtCOR47蛋白比GhDHN1多1个K片段有关，今后的工作重点可适当集中到对K片段功能的研究上。

许多脱水素响应激素脱落酸的刺激，因此被称为 RAB 蛋白（Responsive to ABA）[16]。 Welin 等[4]研究表明，AtCOR47响应低温胁迫的同时响应脱落酸 （ABA）和干旱胁迫，因此属于RAB蛋白。GhDHN1和AtCOR47的启动子中均含有脱落酸响应元件和参与干旱诱导的MYB结合位点元件，所以推测，GhDHN1也可能属于RAB蛋白，同时响应ABA胁迫和干旱胁迫，该结论需进一步的试验验证。

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