人源性乙酰胆碱受体α亚基胞外肽段的原核表达与血清学诊断研究

许胜杰，孙卫国，陈玉萍，王中魁，陶晓勇，王卫

解放军第三〇九医院 a.神经内科；b.全军结核病防治重点实验室，结核病诊疗新技术北京市重点实验室；北京 100091

重症肌无力（myastheniagravis，MG）是一种自身免疫性疾病，机制为血清中大量生成的乙酰胆碱受体（acetylcholine receptor，AchR）抗体与AchR结合，导致AchR生理功能低下，引发肌肉疲乏无力症状[1]。目前在我国人群中MG发病率较高，早发现及时治疗对改善预后具有重要意义。研究表明，血清中AchR抗体滴度与MG的病情密切相关，通过检测患者血清中AchR抗体水平可以对MG患者进行初步临床诊断和病情评估。神经肌肉接头处突触后膜的AchR是一个由4种亚基构成的五聚体跨膜蛋白，其中α亚基上存在众多抗原表位，AchR特异性T细胞及B细胞表位几乎均存在于α亚基上，α亚基有望作为抗原用来检测MG患者血清AchR抗体[2]。α亚基是一个具有4个跨膜区域的跨膜蛋白，其胞外域可用于免疫吸附、免疫动物制备实验性重症肌无力动物模型。我们构建了AchR的α亚基胞外氨基酸即第1～221位氨基酸（aa）序列的融合表达载体pETNusA-AchR-α，原核表达获得融合蛋白NusAAchR-α，纯化重组蛋白后进行血清学鉴定，对重组蛋白用于MG患者血清学诊断的价值进行评估，探讨开发临床检测MG试剂盒的可行性。

1 材料与方法

1.1 材料

临床阳性血清来自本院神经内科住院MG患者200例；健康人血清来自本院体检中心60例；大肠杆菌BL21（DE3）、质粒pET-NusA由本室保存；全基因和引物由华大基因公司合成；限制性内切酶HindⅢ和XhoⅠ、T4DNA连接酶购自NEB公司；TaqDNA聚合酶和dNTP购自天根生化生物公司；HRP酶标羊抗人IgG购自华美生物技术公司；琼脂糖为Spain公司产品；IPTG为Merck公司产品；蛋白质相对分子质量marker为Sigma公司产品；其他试剂为进口或国产分析纯产品。

在这个例句中，根据句义“the man to help you”可以理解为“the man who helps you”。因此，the man与help构成了主谓关系。

1.2 全基因与引物合成

全合成α亚基胞外氨基酸序列对应的核酸序列（GenBank：M64695），在上、下游 5′和 3′端分别引入HindⅢ酶切位点（AAGCTT）和XhoⅠ酶切位点（CTCGAG），在 3′端引入原核终止密码子TAA。合成全序列为：

aagcttTCCGAACATGAGACCCGTCTGGTGGCAAAGCTATTTAA AGACTACAGCAGCGTGGTGCGGCCAGTGGAAGACCACCGCCAGG TCGTGGAGGTCACCGTGGGCCTGCAGCTGATACAGCTCATCAAT GTGGATGAAGTAAATCAGATCGTGACAACCAATGTGCGTCTGAA ACAGCAATGGGTGGATTACAACCTAAAATGGAATCCAGATGACT ATGGCGGTGTGAAAAAAATTCACATTCCTTCAGAAAAGATCTGG CGCCCAGACCTTGTTCTCTATAACAATGCAGATGGTGACTTTGC TATTGTCAAGTTCACCAAAGTGCTCCTGCAGTACACTGGCCACA TCACGTGGACACCTCCAGCCATCTTTAAAAGCTACTGTGAGATC ATCGTCACCCACTTTCCCTTTGATGAACAGAACTGCAGCATGAA GCTGGGCACCTGGACCTACGACGGCTCTGTCGTGGCCATCAACC CGGAAAGCGACCAGCCAGACCTGAGCAACTTCATGGAGAGCGCC CCGACACCCCCTACCTGGACATCACCTACCACTTCGTCATGCAG CGCCTGTAActcgag

合成的阳性鉴定引物为：

正向 5′-CCCaagcttTCCGAACATGAGACCCGTCT-3′

反向 5′-CCGctcgagTTACAGGCGCTGCATGACGAAGTGG-3′

1.3 pET-NusA-AchR-α重组质粒的构建

合成的序列及表达载体pET-NusA分别用HindⅢ和XhoⅠ双酶切后切胶回收，回收后的产物按浓度比3∶1过夜连接，连接产物转化感受态大肠杆菌BL21（DE3），筛选PCR阳性菌落进行测序，获得工程菌pET-NusA-AchR-α。

1.4 NusA-AchR-α融合蛋白的原核表达

将阳性工程菌株转接至含卡那霉素的LB培养基中，于37℃振荡活化，扩大培养中检测细菌菌液D600nm值为0.4时加入IPTG（终浓度0.3mmol/L），37℃继续诱导7h，离心收集菌体，在冰浴状态下进行超声波破碎，高速离心（12000r/min，30min），取上清和沉淀进行SDS-PAGE分析。

1.5 NusA-AchR-α融合蛋白的纯化

取超声波破碎后上清，加入咪唑至终浓度为10mmol/L，充分混匀，通过镍离子螯合的亲和层析柱对目的蛋白进行亲和纯化，分别以30mmol/L咪唑除去菌体自身蛋白、150mmol/L咪唑洗脱收集目的融合蛋白，通过12%SDS-PAGE分析纯化后目的蛋白的纯度。

1.6 NusA-AchR-α融合蛋白的免疫印迹与ELISA分析

取NusA-AchR-α融合蛋白冻干粉末，用PBS缓冲液稀释成1mg/mL的母液，吸取2μL加入上样缓冲液煮沸8min，经12%SDS-PAGE后转移到硝酸纤维素膜上，用5%的脱脂奶粉封闭后，依次以确诊阳性MG患者血清、HRP标记的羊抗人IgG孵育，漂洗干净，通过ECL进行暗室自动曝光显影，分析重组蛋白的抗原性。

用碳酸钠溶液将融合蛋白稀释至4μg/mL备用，酶标板包被过夜后，37℃封闭2h，用PBST充分洗板5次，确诊MG患者血清和健康人血清（1∶200）于37℃孵育1h，重新洗板若干次，每孔中加入用PBS稀释至1∶1000的HRP标记的羊抗人IgG100 μL，37℃振荡孵育1h，再洗板 5次，加入TMB显色液反应30min显色，终止反应，酶标仪检测D450nm值，结果判定以待测样本的D450nm值与阴性对照的D450nm值之比≥210（P/N≥210）为阳性，显示阳性结果的最大抗体稀释度为血清效价。

2 结果

2.1 pET-NusA-AchR-α表达载体的构建

通过全基因合成的方法获得AchRα胞外肽段核酸全序列，克隆到载体pET-NusA中，以合成的引物通过菌落PCR筛选阳性克隆进行测序保存。PCR产物的1%琼脂糖电泳结果见图1，在约660bp处有单一的条带，和预期结果一致。

2.2 NusA-AchR-α融合蛋白的表达与纯化

NusA-AchR-α融合蛋白的相对分子质量约为80000（图2），与预期一致，目的蛋白的表达量占细菌总蛋白的25%～35%。SDS-PAGE分析表明重组蛋白主要表达于上清中，这同理论结果相同。前期实验中，我们尝试将AchRα亚基胞外段用pET-22b载体进行非融合表达，但没有获得成功。

图1 AchRα胞外肽段核酸PCR产物的凝胶电泳鉴定

对重组 NusA-AchR-α表达后的上清液进行亲和柱纯化，SDS-PAGE分析纯化结果，重组蛋白纯度可达90%以上（图3）。

2.3 NusA-AchR-α融合蛋白的Western印迹鉴定

以确诊的MG患者血清为一抗与NC膜进行孵育，Western印迹表明融合蛋白NusA-AchR-α与MG患者血清结合，在胶片上显示出条带（图4）。而对照的NusA蛋白在对应位置没有出现条带。实验说明，纯化后的重组蛋白NusA-AchR-α相对于MG患者血清具有强的抗原性及特异性。

2.4 融合蛋白NusA-AchR-α的ELISA鉴定

收集200份MG患者血清和100份健康人血清对纯化的NusA-AchR-α重组蛋白进行ELISA分析，发现常规ELISA最佳重组抗原包被浓度为4μg/mL，96孔包被板背景较深，非特异结合较强，其中MG患者检出120例，检出率为60%；健康人血清检出5例，特异度为95%。

图2 pET-NusA-AchR-α原核表达产物的SDS-PAGE

图3 NusA-AchR-α亲和纯化的SDS-PAGE分析

图4 NusA-AchR-α和MG患者血清的Western印迹抗原性分析

3 讨论

在MG患者发病过程中有多种抗体参与[3]，我院神经内科研究发现MG患者的患病程度与Titin抗体浓度呈正相关[4]。刘岚剑等[5]研究发现，MG患者血清AchR抗体和Titin抗体阳性率均明显高于对照组，AchR抗体与Titin抗体检测重症肌无力的敏感度分别为76.3%和52.5%，2种抗体并联后敏感度可提高到86.3%。通过检测患者血清AchR抗体水平，可以初步预判MG症状，目前国内市场还没有血清学检测MG疾病的试剂，临床检测主要依赖国外进口试剂盒。为了对AchR抗体进行血清学检测，我们尝试对AchR的α亚基胞外段进行体外重组。同时，参考NusA蛋白标签系统能显著提高外源蛋白的可溶性表达功能，并且NusA标签还能使目的蛋白仍保持正确折叠和生物学活性的作用，将AchR-α与NusA进行融合表达，获得了重组NusA-AchR-α的可溶性表达，在后期的ELISA实验中，由于显色背景较深，阳性检出率不是很理想，但相对于对照血清而言还是能初步进行甄别。后期实验我们将对AchR序列进行抗原优化以提高特异性。本实验为开发MG临床血清学诊断研究做了初步尝试，也能为今后开发血清学检测试剂盒提供参考。