梅毒IgA快速检测试剂诊断早期现症梅毒的应用性评估

韩燕 魏万惠 尹跃平 David Anderson 王红春 Mary L Garcia Huy Van 朱小宇 陈凯 陈祥生

210042南京，中国医学科学院 北京协和医学院 皮肤病研究所 中国疾病预防控制中心性病控制中心参比实验室（韩燕、魏万惠、尹跃平、王红春、朱小宇、陈凯），性病控制中心（陈祥生）；Burnet Institute（David Anderson、Mary L Garcia、Huy Van）

梅毒螺旋体在母体内通过胎盘途径感染胎儿，可引起早产、死产。加强孕妇的梅毒筛查，是减少梅毒垂直传播的关键［1-3］。目前，梅毒的快速检测试剂（POC，point-of-care）主要检测梅毒的特异性抗体，不能够有效区分现症和既往梅毒感染，还需要快速血浆反应素环状卡片试验（RPR）/甲苯胺红不加热血清试验（TRUST）的辅助，限制了快速检测方法的应用。澳大利亚Burnet研究所研发了一种可快速鉴定患者是否为早期现症梅毒的POC试剂（prototype IgA rapid test），前期Burnet研究所利用墨尔本参比实验室提供的100份血浆标本检测，显示该试剂对现症梅毒患者血浆（RPR滴度≥1∶8）检测的灵敏度为91%，对既往梅毒患者血浆［梅毒螺旋体血球凝集试验（TPHA）阴性，RPR阴性］的检测特异性为80%。在本研究中，我们对该快速检测试剂进行了扩大样本量的实验室评估。

一、对象和方法

1.标本：血清标本来自中国医学科学院皮肤病研究所参比实验室。由于库存标本缺少患者主诉相关信息，我们主要依靠IgM酶联免疫吸附实验（IgM-ELISA）、IgA-ELISA检测的结果进行未感染梅毒、既往感染梅毒和早期现症梅毒的分组。本研究通过中国医学科学院皮肤病研究所医学伦理委员会批准（2016-临快审-016）。

2.试剂：TPHA试剂、RPR试剂（英国Omega Diagnostics公司）；IgA-POC及IgA-ELISA试剂均由Burnet研究所提供，其制备IgA快速检测试纸条中所使用的IgA抗原梅毒重组抗原购自美国Meridian Life Sciences公司；IgM-ELISA试剂（德国DRG公司）。

3.分组：标本管理员根据标本库原先记录的检测结果进行标本抽样，完成抽样后，所有标本经TPHA和RPR检测，并利用IgM-ELISA发现TPHA和RPR检测漏检的早期梅毒感染者。未感染组：IgM-ELISA检测阴性或TPHA检测阴性且RPR检测阴性；既往感染组：TPHA检测阳性、RPR检测阴性且IgM-ELISA阴性；早期现症组：IgM-ELISA检测阳性或TPHA检测阳性、RPR检测阳性且滴度大于1∶8。为保证检测人员对TPHA和RPR结果的盲法，在完成分组标本的筛选后，对标本二次编号，号码按照随机数生成器产生，然后按序排列。实验人员在后续过程中对所有标本前期的检测结果及分组信息未知。

4.IgA-POC检测：冻存标本室温孵育至室温后，10 000×g离心5 min，加入5 μl血清标本至检测板的A孔，然后加入1滴磷酸盐缓冲液（PBS），10 min后再加入4滴PBS至B孔，20 min后观察，质控线出现粉红色条带时检测有效，检测线出现粉红色条带为阳性。

5.IgA-ELISA检测：在96孔板中包被IgA抗原作为IgA-ELISA的检测板。在酶标板孔中加入100 μl标本，37 ℃孵育1 h，洗板6次后加入100 μl抗人IgA辣根过氧化酶溶液继续37℃孵育1 h，洗板6次后加入3，3′，5，5′-四甲基联苯胺（TMB）底物100 μl，11 min后加入100 μl终止液，利用酶标仪检测吸光度（A值）。利用阴性质控及空白质控计算灰区值（cutoff），cutoff=（A阴性-A空白）× 0.9。每批实验单独计算cutoff值，检测的吸光度大于或等于cutoff值则判为阳性，小于cutoff值判为阴性。

6.统计学分析：采用SPSS 20进行统计分析。IgA-POC与IgM-ELISA方法灵敏度和特异性比较采用Z检验，IgAPOC与IgA-ELISA方法的比较采用配对资料McNemar检测，以P＜0.05为差异有统计学意义。

二、结果

1.基本情况：抽取库存标本458份，男性标本241例，女性标本215例，2份标本缺少性别信息；年龄（38.2±12.3）岁。未感染梅毒148份、既往感染梅毒147份、早期现症梅毒163份（表1）。现症梅毒组有9例RPR阴性、IgM-ELISA阳性，其余154例RPR滴度在1∶8至1∶256之间，其中1∶16、1∶32及1∶64这3个滴度标本占全部标本80%左右。

2.IgA-POC与IgM-ELISA、IgA-ELISA检测结果比较：3份标本（0.65%）未出现质控线，没有纳入最终IgA评估，455份血清用于检测，结果见表2。IgM-ELISA试剂检测结果出现在灰区16份，占总标本的3.52%（16/455）。IgA-POC对早期现症感染诊断的灵敏度（92.64%）高于IgM-ELISA（Z=6.88，P＜0.05）；对既往感染排除诊断的特异性（72.22%）低于IgMELISA（Z=6.18，P＜0.05）；对未感染排除诊断的特异性（97.97%）与IgM-ELISA相比差异无统计学意义（Z=1.16，P=0.25）。IgA-POC对非早期现症梅毒排除诊断的特异性为85.27%，约登指数为64.86%；IgM-ELISA的特异性为99.32%，约登指数为58.83%。

IgA-ELISA与IgA-POC的检测能力差异有统计学意义（McNemarχ2=11.70，P=0.00）（表3）。IgA-POC对早期现症感染诊断的灵敏度及对既往感染排除诊断的特异性与IgAELISA差异无统计学意义（Z值分别为0.21、0.26，P＞0.05），但对未感染排除诊断的特异性高于IgA-ELISA（Z=4.68，P＜0.05）；对非早期现症梅毒排除诊断的特异性为75.34%，低于IgA-POC的97.97%，约登指数为45.48%。

表1 458份血清标本IgM-ELISA、梅毒螺旋体血球凝集试验（TPHA）和快速血浆反应素环状卡片试验（RPR）结果

表2 IgA快速检测试剂（IgA-POC）、IgM-ELISA、IgA-ELISA对不同感染状态的梅毒血清标本的检测结果比较［例（%）］

三、讨论

梅毒特异性IgM和IgA可随着感染的时间及治疗而逐渐消失［4］，且分子量比较大难以通过胎盘屏障［5］，因此IgM和IgA抗体的检测可用于梅毒的早期诊断。本研究利用库存标本对梅毒IgA-POC进行了早期现症梅毒诊断的应用性评估，结果显示，该试剂对早期现症梅毒的发现能力达93%，对未感染梅毒和既往感染梅毒的排除率分别达98%和72%。目前IgA-POC尚处于研发阶段，对现症梅毒诊断特异性和灵敏度尚不能与美国Chembio公司梅毒双检的方法相媲美［6］，但基本符合WHO对于新开发的POC试剂要求（临床灵敏度和特异性均大于80%）。由于该检测方法简便易行，所需实验室条件和设备要求不高，因此可以在实验室条件简陋的诊所或现场调查中推广。

由于IgM在感染者体内消失得较快，IgM-ELISA对早期现症感染的检测灵敏性低，应用该方法进行现症梅毒筛查时常会出现漏诊［7］，因此IgA检测是对IgM检测诊断早期梅毒的有效补充。而本研究通过对IgA-POC与IgA-ELISA的比较发现，IgA-POC检测未感染排除诊断的特异性高于IgAELISA，这可能与两种方法的操作过程有关：IgA-POC抗原包被过程是通过胶体金划线仪将抗原划至硝酸纤维膜上，而IgA-ELISA主要通过排枪移液器吸附至96孔板；IgA-POC的检测为两步法，而IgA-ELISA涉及的步骤较为繁琐，没有实现自动化，增加了人为因素的干扰。

本研究使用的是库存标本，缺少临床诊断相关信息，因此可能存在错误分组的情况，影响对该试剂的灵敏度和特异性的计算，需要进一步开展多中心临床标本评估。

表3 IgA-ELISA与IgA快速检测试剂（IgA-POC）检测结果比较