不同抗性烤烟根系分泌单糖特征及其对黑胫病菌的化感效应

桑正林，杨顺强，武 婷，吴银梅，赵启君

(昭通学院，云南昭通 657000)

根系分泌物是植物与土壤进行物质交换和信息传递的重要载体物质，是植物响应外界胁迫的重要途径，是构成植物不同根际微生态特征的关键因素，同时也是根际对话的主要调控者[1]。植物通过根系的分泌作用，实现植物与根际环境间的物质、能量与信息的交流，它是植物对环境的一种适应性机制，植物根系分泌物的化感作用被更多、更准确的看作是一种生态学现象[2-3]。根系分泌物中的化感物质种类和数量受物种、生长环境、营养状况、气候因子、生长阶段等因素影响[4]。一般认为，植物感病品种的根系分泌物能刺激病原菌孢子萌发，而抗病品种的根系分泌物则抑制孢子萌发[5-6]。黄瓜根系分泌物中总氨基酸含量随品种抗性的增加而降低，其中苯丙氨酸含量与黄瓜枯萎病病情指数呈显著正相关[7]；黑豆、豆角、番茄的根系分泌物可通过抑制黄瓜种子发芽势来抑制其发芽[8]；茄子根系分泌物中的香草醛可促进茄子种子萌发和幼苗生长，而肉桂酸对黄萎菌的孢子萌发、茄子种子萌发及幼苗生长均表现为抑制作用[9]。

烟草黑胫病是烟草上普遍发生，危害较大的土传性真菌病害，几乎可以为害任何生长阶段的烟草植株和侵染所有栽培品种，在某些病害严重的地块，烟草黑胫病的发病率高达 75%以上，严重影响了烟草产量和品质的提高。不同抗性蚕豆品种根系分泌物中总糖含量随抗病性的降低而升高，抗病品种的根系分泌物抑制了尖孢镰刀菌的孢子萌发和菌丝生长，感病品种根系分泌物则显著促进尖孢镰刀菌孢子萌发和菌丝生长[10]；西瓜根系分泌物中可溶性糖含量显著高于水稻的，感病西瓜品种根系分泌物中的可溶性糖含量又显著高于抗病品种[11]。烟草黑胫病的发生应该与其根系分泌物存在一定的关联，但针对烤烟根系分泌物及化感作用的品种差异研究还鲜有报道，为此，本试验采用对烟草黑胫病不同抗性的4个烤烟品种为材料，研究各烤烟品种根系分泌单糖的特点及单糖对烟草黑胫病菌的化感作用，探究烤烟根系分泌单糖及其对黑胫病化感作用的品种差异，为烤烟品种选育及病害防治提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 材料及其培养

参试烤烟品种中，‘NC102’为高抗黑胫病烤烟品种，‘K326’为中抗黑胫病烤烟品种，‘云烟87’为中感黑胫病烤烟品种，‘红花大金元’为高感黑胫病烤烟品种[12]。采用漂浮育苗法育苗，2012年4月30日，采用上口直径43 cm、底部直径30 cm、高35 cm的塑料盆进行盆栽。盆栽用土为未种植过烤烟的耕层土，每盆装土25 kg，盆栽土壤有机质61.60 g·kg-1、pH值6.54、碱解氮67.47 mg·kg-1、有效磷30.84 mg·kg-1、速效钾269.30 mg·kg-1。每盆1株，每品种移栽30盆。采用烟草专用复混肥料(N∶P2O5∶K2O=12∶10∶24)作为肥源，一次性作为底肥施入，每盆施8 g纯氮。烟苗移栽后置于云南农业大学校内塑料大棚内，期间采用相同的管理方法培养烟株。

1.2 单糖对烟草黑胫病菌的化感试验

黑胫病菌从云南昭通市昭阳区守望乡感染黑胫病的烟株上分离获得，经分离、培养、镜检、再接种观察， 确定为黑胫病菌。采用燕麦培养基(燕麦片30 g， 琼脂18 g， 蒸馏水1 000 mL)培养黑胫病菌。在直径75 mm培养皿中加入10 mL琼脂培养基(琼脂18 g，蒸馏水1 000 mL)，根据根系样品中各单糖的平均浓度，配制4.000、2.000、1.000、0.500 mg·mL-1的葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖和混合糖(取4.000、2.000、1.000、0.500 mg·mL-1的木糖、阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖溶液等体积混合，分别得4.000、2.000、1.000、0.500 mg·mL-1的混合糖溶液)溶液。2013年3月20日，取上述糖溶液各3 mL分别加入到装有琼脂培养基的培养皿中，取长势健壮、一致的黑胫病菌，在无菌条件下用孔径5 mm的打孔器取黑胫病菌块，分别接种于已加入不同浓度糖溶液的培养皿中央，每皿接种1个菌种块，对照(CK)组加入去离子水3 mL，每处理3次重复。置于25 ℃条件下培养、观察，于培养的第4、5、6、7天上午9:00用游标卡尺测定菌落直径，采用十字形测定后求平均值代表其菌落直径。

1.3 烤烟根系及根际土的取样及处理

参照李世清等[13-14]的方法。分别在烤烟的团棵期、旺长期、现蕾期和成熟期取样，各品种选取生长一致的3株取混合样。小心将烟株从盆内取出，轻轻抖落根系外围土壤， 收集紧密附着于根系上的土壤，带回室内挑出根系、碎石等杂质，风干至恒重，过40目筛，得根际土样；将根系用自来水冲洗干净，再用蒸馏水冲洗3遍，剪取直径小于1 mm的侧根，105 ℃杀青20 min，65 ℃烘干至恒重，粉碎，过40目筛，得根系样。

1.4 标准品和样品的衍生及单糖含量测定

参照杨兴斌等[15]的方法。取葡萄糖、阿拉伯糖、核糖、半乳糖、木糖和鼠李糖标品用重蒸水配成1 000、500、250、100、50、10、5 和0 μg·mL-1的系列混合标准溶液，分别取混合标准溶液200 μL，依次加入0.5 mol·L-1的PMP(1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮)甲醇溶液100 μL，0.3 mol·L-1的NaOH溶液100 μL，摇匀，70 ℃水浴30 min，冷却，加0.3 mol·L-1的HCl溶液100 μL，摇匀后，加入1 mL氯仿萃取3次后，过0.45 μm微孔滤膜，得标准衍生液。称取0.2 g根系样，放入5 mL离心管中，加入4 mL重蒸水，超声提取30 min后，12 000 r·min-1，5 ℃离心15 min，上清液在50 ℃下减压浓缩至干，用1 mL重蒸水分3次冲洗，合并得提取液。取提取液200 μL，其衍生方法同标准溶液；称取10 g根际土样，放入50 mL离心管中，加入40 mL重蒸水，剩余步骤同根样。

标准液、根样和土样衍生液的单糖含量采用高效毛细管区带电泳法测定。毛细管总长度48.5 cm，有效柱长为39.0 cm，内径为75 μm；硼砂缓冲液：50 mmol·L-1，pH 10.80；温度：20 ℃；电压：10 kV；进样方式：5 000 Pa压力自动进样5 s，检测波长为245 nm。每次进样前，依次用0.1 mol·L-1NaOH溶液、重蒸水、硼砂缓冲液冲洗毛细管柱3 min。

1.5 数据处理

采用SPSS17.0软件进行数据分析，多重比较采用Duncan法。

单糖对黑胫病的化感效应采用 Willamson[16]的化感作用效应指数(response index，RI)法进行分析。

(1)

(2)

其中：C为对照值；T为处理值，RI为化感效应指数(RI>0，为促进作用；RI<0，为抑制作用，绝对值大小与作用强度一致)。

2 结果与分析

2.1 标准品和样品中单糖的毛细管电泳图谱和标准曲线

将衍生后的混合单糖标准液、根系样品提取液及根际土样品提取液上机检测，在21 min内， 标准液检出了木糖、阿拉伯糖、核糖、葡萄糖、鼠李糖和半乳糖6种单糖，获得了基线稳定、无拖尾、灵敏度高的理想毛细管电泳图谱， 根系及根际土样品也检出了多种单糖(图1)。根据混合标准溶液的毛细管电泳图谱，以质量浓度对峰面积制作标准曲线， 得出各单糖浓度与峰面积的线性关系，经统计学检测线性关系良好(表1)，可作为计算样品中单糖含量使用。

2.2 烤烟根际土中主要单糖含量在发育时期间和品种间的差异

各品种烤烟根际土中检出的主要单糖组分及含量随着发育时期的变化而存在差异(表2)。‘云87’和‘红花大金元’根际土中的木糖、阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖均在团颗期时含量高；‘NC102’和‘K326’根际土中的木糖、阿拉伯糖和葡萄糖在现蕾期和成熟期时含量较高；各烤烟品种检出的单糖中葡萄糖在各时期含量均最高，其含量在团棵期时表现为‘NC102’(2.255 μg·g-1)<‘K326’(4.774 μg·g-1)<‘云87’(7.100 μg·g-1)<‘红花大金元’(11.068 μg·g-1)。根际土单糖总量(4种单糖之和)同样因烤烟品种、生育时期不同而存在差异。‘NC102’在成熟期时含量最高(11.127 μg·g-1)，‘K326’在现蕾期含量最高(8.337μg·g-1)，‘云87’在旺长期含量最高(10.877 μg·g-1)，‘红花大金元’在团颗期时含量最高(15.579 μg·g-1)；在团棵期时，各品种间单糖总量顺序为‘NC102’<‘K326’<‘云87’<‘红花大金元’。以上结果表明：根际土中含量最高的单糖为葡萄糖，高感和中感黑胫病烤烟品种在团颗期时各单糖含量较高，使其单糖总量较高，为烟草黑胫病菌的生长提供了物质和能量，使烤烟容易感病。

1.PMP； 2.木糖； 3.阿拉伯糖； 4.核糖； 5.葡萄糖； 6.鼠李糖； 7.半乳糖图1 标准液和团棵期‘K326’样品中单糖的毛细管电泳图谱1.PMP； 2. Xylose； 3. Arabinose； 4. Ribose； 5. Glucose； 6. Rhamnose； 7. GalactoseFig.1 HPCE electrophoretogram of mixed standard solution and samples in ‘K326’ variety at rosette stage

单糖Monosaccharide标准曲线Standard curve相关系数(r)Correlation coefficient单糖Monosaccharide标准曲线Standard curve相关系数(r)Correlation coefficient木糖 Xylosey=1 019.2x-5 360.30.998 6葡萄糖 Glucosey=416.15x-2 543.10.997 1阿拉伯糖 Arabinosey=1 146.9x-2 7720.999 2鼠李糖 Rhamnosey=822.24x+862.230.997 1核糖 Ribosey=738.59x+742.970.999 9半乳糖 Galactosey=1 093.1x+2 800.20.999 0

2.3 烤烟根系中主要单糖含量在品种间和生育期间的差异

在烤烟根系中检出的木糖、阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖含量因烤烟品种和生育时期的不同而变化(表3)。烤烟根系木糖和阿拉伯糖含量在品种‘NC102’、‘K326’、‘红花大金元’中呈升高-降低-升高的变化趋势，在品种‘云87’中则呈先升高后降低的变化趋势，均在旺长期时含量最高；各烤烟品种根系中葡萄糖含量在各发育时期均高于同期其他单糖含量，且均随着生育期呈先升高后降低的变化趋势，在现蕾期时含量显著高于其余时期。‘NC102’木糖含量在旺长期、现蕾期和成熟期时显著高于其他品种；‘NC102’中阿拉伯糖含量在旺长期和成熟期显著高于其他品种，‘云87’的阿拉伯糖含量则在团颗期和现蕾期显著高于其他品种；‘NC102’的葡萄糖含量在旺长期和现蕾期显著高于其他品种，‘红花大金元’的葡萄糖含量则团颗期和成熟期显著高于其他品种；‘NC102’中半乳糖含量在团颗期、旺长期和成熟期时显著高于其他品种。随着生育期的推进，各品种根系单糖总量均呈现出先升后降的变化趋势，并均在现蕾期达到最大值，且显著高于其余生育期；在团棵期时，单糖总量以‘NC102’和‘红花大金元’最高，且差异不显著，而‘云87’的最低(6 574.259 μg·g-1)；在旺长期时，‘NC102’单糖总量显著高于其余品种；现蕾期时，各品种间单糖总量均处于最高水平，品种间差异显著，‘云87’的单糖总量最低；成熟期时，‘红花大金元’的单糖总量最高(15 171.738 μg·g-1)， ‘NC102’最低(4 537.383 μg·g-1)。上述结果表明：根系中单糖的种类及含量与烤烟抗黑胫病的相关性不明显。

2.4 不同浓度糖溶液对烟草黑胫病菌菌落生长的影响及其化感效应

烟草黑胫病菌菌落直径在不同浓度混合糖和各单糖溶液处理后均显著大于对照，均随处理时间的延长而逐渐增大；各浓度溶液对菌丝生长均表现为显著促进作用，且浓度间存在显著性差异，但又因单糖种类和浓度的不同而存在差异(图2)。其中，黑胫病菌菌落直径基本随混合糖浓度升高而增大，在4.000 mg·mL-1浓度处理第4 天和第7天时分别为48.932和68.317 mm，分别是同期对照的10.715和7.505倍；在整个观测期内，混合糖浓度较高处理的黑胫病菌菌丝生长较快，菌落直径较大(图2，A)。同时，黑胫病菌丝在2.000 mg·mL-1葡萄糖处理下生长最快，并显著高于其余浓度处理，其第7 天时菌落直径(68.940 mm)是同期对照的7.573倍(图2，B)；黑胫病菌丝在1.000和2.000 mg·mL-1木糖溶液处理下生长较快，其第7 天时菌落直径分别达63.607 和63.237 mm，分别是同期对照的6.947和6.687倍(图2，C)；而黑胫病菌菌落直径在1.000 mg·mL-1阿拉伯糖处理4 d后就达40.420 mm，在2.000 mg·mL-1浓度处理第7天时达68.817 mm，此时为同期对照的7.560倍(图2，D)；黑胫病菌菌丝生长在2.000 mg·mL-1半乳糖溶液处理下受到促进作用最强，并始终显著高于其余浓度处理，其处理第7天时菌落直径是同期对照的7.418倍(图2，E)。以上菌落直径的结果分析表明，黑胫病菌菌丝的生长因单糖种类、浓度及作用时间的不同而不同。

表2 各烤烟品种根际土中主要单糖含量比较分析

注：不同小写与大写字母分别表示同列和同行在0.05水平下的差异显著性，以下各表与此相同

Note: The different normal and capital letters among same column indicated significant difference at 0. 05 level. The same as follows

表3 各烤烟品种根系中主要单糖比较分析

A.混合糖；B.葡萄糖；C.木糖；D.阿拉伯糖；E.半乳糖； 同一时间不同字母表示处理间在0.05水平存在显著性差异图2 不同浓度糖溶液处理下黑胫病菌落生长的变化A.Mixed sugar；B.Glucose；C.Xylose；D.Arabinose；E.Galactose； The different normal letters within the same stage indicate significant difference among treatments at 0.05 levelFig.2 The growth of P. parasitica var. nicotiana colonies under different concentrations of saccharide

进一步的化感效应分析发现，各单糖在所设浓度下对黑胫病菌菌丝生长的化感作用指数均为正值，表现为促进作用(表4)。其中，在单一糖处理下，黑胫病菌菌丝生长的化感作用指数表现为随浓度增加先升高后降低的趋势，并大多在2.000 mg·mL-1浓度处理下化感作用指数最大，促进作用最强，而在4.000 mg·mL-1浓度处理下化感作用指数有所降低，促进作用有所减弱；混合糖处理下，化感作用指数随糖溶液浓度的增加而增大，并在4.000 mg·mL-1浓度处理下最大，促进作用最强。

3 讨 论

在本研究中，各烤烟品种的根际土和根系中在烤烟不同发育时期中均检出了木糖、阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖，检出的各糖组分及含量因烤烟品种、生育时期及部位不同而存在差异；在烤烟团棵期时，抗病品种‘NC102’、‘K326’根际土中的葡萄糖、单糖总量较感病品种‘云87’、‘红花大金元’低。同时，不同浓度木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖和混合糖溶液处理对黑胫病菌菌丝的生长均表现为促进作用，这种促进作用因糖种类、浓度和处理时间不同而存在差异，且在单一糖处理下以浓度为2.000 mg·mL-1时促进作用最强，在混合糖溶液处理下以浓度为4.000 mg·mL-1时促进作用最强。可见，烤烟感病品种能够分泌较多的葡萄糖和其他单糖到根际土中，从而促进烟草黑胫病菌的生长，导致发病。

表4 不同类型单糖对黑胫病菌的化感作用指数

植物根系分泌物的产生和释放是植物在环境胁迫压力下形成的，是植物在进化过程中产生的一种对环境的适应性机制[17]。目前根系分泌物的产生机制还不十分清楚，主要观点有主动释放、被动释放、代谢途径、非代谢途径[18]。本试验中，烤烟根系与根际土中的单糖含量对应性不强，表明烤烟根系分泌单糖可能主要是一种主动释放，与烤烟品种特性有关；在烤烟生长过程中，随发育时期不同，根系分泌物的数量和种类存在差异，根际微生物的数量亦随之发生变化[19]。烟草不同生育阶段对黑胫病的抗性也存在较大差异，烟草黑胫病的爆发多发生在高温高湿的季节，从大田生育期来看，以团棵期至旺长期前后发病普遍，盛发期是现蕾阶段[20]。本试验中，感病烤烟品种从移栽后至团棵期期间分泌到根际土中的葡萄糖、单糖总量比抗病品种的高，而各单糖及混合糖溶液对黑胫病菌的生长均起促进作用。烟草黑胫病是土传真菌病害，感病品种之所以较抗病品种易感病，原因可能是感病品种在生长发育前期通过根系分泌较多的单糖到根际土中，为土壤中黑胫病菌的生长发育提供了物质和能源，促进了烟草黑胫病菌的生长，导致烟草黑胫病的发生。

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