阳和化岩汤联合曲妥珠对HER-2高表达型乳腺癌细胞PTEN-PI3K/Akt通路及VEGFC的影响研究

张 洋刘晓菲王 楠朱 晴韩 笑

（1.山东中医药大学中医学院，山东济南250014； 2.山东中医药大学第一临床学院，山东济南250335）

HER-2阳性乳腺癌是一种原癌基因过度表达的疾病，具有高趋化、高侵袭、恶性程度高、预后较差且易复发的特点[1]。从中医学角度，HER-2高表达型乳腺癌患者具备先天不足的病因，其肿瘤细胞低分化、增殖速度快、易复发转移、具有耐药性等符合正虚毒恋的病机。临床使用曲妥珠单抗治疗HER-2高表达型乳腺癌取得较好疗效，但成本高且耐药性增加[2]，遂从中医角度探索更好的解决方法。本实验采用的阳和化岩汤由《外科证治全生集》“阳和汤”化裁而来，课题组前期检测到阳和化岩汤在体内实验的caspase信号上游有PI3K的异常活化[3]，故本研究从HER-2介导的PI3K/Akt通路探讨阳和化岩汤联合曲妥珠对HER-2高表达乳腺癌的干预机制。

1 实验材料

1.1 动物及细胞系来源 乳腺癌细胞株SK-BR-3（HER-2高表达型：ERa66-/Era36-PR-/HER2+/EGFR+），中国科学院上海生科院细胞资源中心。出生后6周健康SD雄性大鼠15只，SPF级，体重（230±10）g，由山东中医药大学实验动物中心提供并饲养，实验动物生产许可证号：SCXK（鲁）2016-0003，实验动物使用许可证号：SYXK（鲁）2016-0019。

1.2 药物与试剂

1.2.1 中药 阳和化岩汤，按鹿角霜-熟地-莪术-山慈菇-土贝片3∶2∶2∶2∶2称取各饮片共50g，按1∶20比例加入95%乙醇溶液回流提取2h，自然冷却，抽滤，得滤液，56℃旋转蒸发至干，以每4g原生药材用25mL Tyrode缓冲盐溶液[4]，超声混匀后得阳和化岩汤供试液，-20℃冰箱保存，使用前置于室温自然解冻。中药饮片购于山东中医药大学附属医院中药房，经药学院鉴定后制剂。

1.2.2 肠吸收液 大鼠禁食12h后，脱颈椎处死，剖开腹腔，取出小肠，自回盲瓣以上5cm起向上选取14cm肠段，用Tyrode缓冲液冲洗，硅胶套管软端插入肠管，丝线结扎，翻转肠道，暴露黏膜层，Tyrode缓冲液冲洗表面，另一端用丝线结扎成囊状，将25mL中药药液预先加入麦氏浴管，通入混合气体（95%O2，5%CO2），37℃恒温，肠管中注入2mL Tyrode缓冲液后放入麦氏浴管，3h后取样40μL，同时补充等体积Tyrode缓冲液，标记后-20℃保存[5]。

1.2.3 供试液 用氮气将所得阳和化岩汤肠吸收液吹干，加入1mL 80%甲醇复溶，超声3min，涡旋30s，0.2μm滤膜过滤。肠吸收液混匀后无菌滤膜滤过除菌，将所得样品分装于无菌EP管中，-20℃保存待用。实验用药时加入以无血清培养基稀释的阳和化岩汤肠吸收液125mg/L。

1.2.4 曲妥珠单抗 曲妥珠单抗以完全培养基稀释，浓度为150μg/mL，上海罗氏制药有限公司提供。

1.2.5 其他试剂 RPIM1640培养基，M199培养基，青、链霉素（Hyclone公司，USA），优级胎牛血清（Gibco公司，USA），平衡盐溶液（Solarbio），蛋白Marker，血管内皮生长因子C，抗Maker小鼠抗β-actin抗体，DAB显色试剂盒、ECL发光剂、一抗稀释液、Western及IP细胞裂解液、蛋白上样缓冲液（碧云天生物科技有限公司），蛋白酶抑制剂（Merck公司），脱脂奶粉（Sigma），所有引物（上海桑尼生物科技有限公司），BCA蛋白浓度测定试剂盒（南京凯基生物科技公司）。

1.3主要仪器CO2培 养 箱（美 国Precision公司），冷冻超速离心机（美国Beckman公司），酶标仪（美国Biotek公司），石蜡包埋机（英国Shandon Histocentre），天能凝胶成像分析系统（深圳天能公司），显影机（日本柯达公司），梯度PCR仪（iCycler型，美国biorad公司），隔水式电热恒温培养箱（上海跃进医疗器械厂）。

2 实验方法

2.1 细胞分组与培养用含10%胎牛血清和1%青、链霉素双抗的高糖DMEM细胞培养液在37℃、5%C02培养箱中孵育乳腺癌SK-BR-3细胞，每24h换液传代，随机选取对数期生长的乳腺癌细胞株，分成4组：对照组，中药组，曲妥珠组，中药+曲妥珠组。在96孔板中加入细胞200μL/孔（约2×105个细胞），于37℃、5%CO2、100%湿度的培养箱内培养24h，待细胞贴壁后加入不同药物处理细胞，对照组加入10μL PBS，药物干预组分别加入10μL阳和化岩汤肠吸收液、曲妥珠、阳和化岩汤肠吸收液+曲妥珠。

2.2 Western blot法检测相关因子蛋白表达 各组细胞培养72h，收集细胞，冷PBS洗涤2次，各加入200μL预冷裂解缓冲液，混匀后冰浴30min，离心，留取上清液并将其稀释到50μg/mL，取等量蛋白（70μg/泳道）上样。电泳条件：浓缩胶恒压60V约20min，分离胶80V约80min。凝胶电泳结束后，将分离到的蛋白条带转移电泳转印至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭1h，分别孵育PTEN、p-Akt、PI3K、VEGFC抗体，4℃过夜。用1×TBST洗涤3次，洗净未结合的一抗，孵育二抗室温1.5h，用1×TBST洗膜，洗去游离二抗，曝光显影。对胶片进行扫描，以目的蛋白质条带的灰度值与内参GAPDH蛋白条带灰度值的比值表示目的蛋白的相对表达水平。

2.3 半定量RT-PCR法检测相关因子mRNA表达 将500μL Trizol试剂分别加入各组细胞，提取总RNA，检验RNA完整性及纯度，当OD260/280比值在1.8～2.0时用于试验。取总RNA为模板逆转录合成cDNA。每个标本重复3遍，以β-actin作为内参照，PCR反应所用引物序列见表1。于紫外透射反射分析仪下拍照，采用图像分析软件分析各电泳条带的积分光密度值，各目标条带积分光密度值与内参照β-actin光密度值的比值为目标基因的相对光表达量。

表1 引物序列

3 实验结果

3.1 各组相关因子蛋白表达比较 见表2。

3.2 各组相关因子mRNA表达比较 见表3。

表2 各组相关因子蛋白表达比较

表3 各组相关因子mRNA表达比较

4 讨论

曲妥珠单抗作为一种人源化单克隆抗体对HER-2过表达的肿瘤细胞具有特异性的靶向治疗作用[6]，有研究表明临床应用曲妥珠靶向治疗1年内发生耐药现象，PI3K/Akt通路的持续激活是导致耐药的重要原因，因此对于具有耐药现象的乳腺癌患者，考虑增加中药治疗或许可以提高机体对曲妥珠的敏感性[7]。

明代陈实功《外科正宗》记载：“初如豆大，渐若棋……日后肿如覆碗……其时五脏俱衰，四大不救，名曰乳岩。”乳岩形成，以“癌毒”为标志，即有形之实邪搏结于乳络，病因乃“阴极阳衰”，肾阳不足，阴寒内生，冲任失调，复感六淫之邪或伤于饮食情志，气机不畅而致痰凝血瘀，当温补肾阳、调摄冲任、行气活血、化痰散结，故选用温阳散结中药阳和化岩汤。方中君药鹿角霜与熟地温补肝肾，填精补髓；土贝化痰散结、排痈消肿，《本草从新》曰其“治外科痰毒”，莪术破血行气、消积止痛，山慈菇解毒化痰散结，三药并用温阳通脉、化痰活血，共为臣药。全方温阳与填精并用，祛痰与通络相伍，阳虚得补，寒痰凝滞得通。

乙醇作为亲水性有机溶剂，溶解性能好，对中草药细胞的穿透能力较强，因此采用乙醇溶液提取中药成分并制备阳和化岩汤肠吸收液，经测定中药成分包括熟地黄多糖、5-羟甲基糠醛、土贝母皂苷、山慈菇多糖、莪术醇、β-榄香烯、姜黄素等，采用肠囊外翻技术，较既往血清药理实验具有含药量高、干扰成分少、活性显著等特点[8]。

PTEN为抑癌基因，相关实验将雌鼠PTEN剔除，结果显示小鼠乳腺癌发生概率升高，其机制与其诱导细胞周期阻滞促进细胞凋亡相关[9]。本研究结果显示，与对照组比较，除中药组外其他治疗组均能明显增强PTEN表达，中药+曲妥珠组表达高于中药组、曲妥珠组，中药组效果不及曲妥珠组，RT-PCR结果相似，中药与曲妥珠联用效果优于单种用药，能够进一步增强PTEN表达，提示中药可能对曲妥珠存在辅助作用。

在抑制肿瘤生成的多种途径中，PI3K/Akt通路发挥了重要作用。Akt属于原癌基因，被PI3K和PDK磷酸化，活化产物为p-Akt，可以通过调控细胞周期、促进血管生成和迁移等途径促进肿瘤的生长[10]。PTEN可通过调节上述通路发挥其肿瘤抑制作用，使生长因子第二信使PIP3变成PIP2，能够特异性去除磷脂酞肌醇-3,4,5三磷酸肌醇环-3位磷酸根，关闭PI3K/AKT及其下游诸多通路，阻碍细胞周期向S期过渡，使细胞在G1期阻滞，抑制肿瘤的生长[11-12]。本实验各药物组均可抑制PI3K、p-Akt表达，中药组、曲妥珠组抑制PI3K、p-Akt效果不及中药+曲妥珠组，曲妥珠+中药组抑制PI3K/Akt信号通路的活化效果最佳，药物联合使用较单种药物作用更明显。

淋巴结转移是乳腺癌常见的转移方式，VEGFC是血管内皮生长因子家族中最强的促淋巴管生成因子，能够调节细胞生物学行为及细胞恶变的发生。VEGFC在乳腺癌组织中呈高表达，与淋巴管密度显著相关[13-14]。本研究结果显示阳和化岩汤能够降低VEGFC表达，效果不及曲妥珠，而中药与曲妥珠联合使用能更好地降低VEGFC的表达。

本实验从PTEN-PI3K/Akt通路方面，重点探讨干预乳腺癌细胞生成的相关因子PTEN、PI3K、p-Akt以及与乳腺癌转移相关的VEGFC的表达，实验结果证明阳和化岩汤肠吸收液联合曲妥珠能够干预PTENPI3K/Akt通路活化，有效增强PTEN表达，降低PI3K、p-Akt及VEGFC的表达，从而抑制乳腺癌细胞生成与转移。虽然单纯使用中药效果不及曲妥珠，但中药与曲妥珠联用显示出更好的治疗效果，提示中药可能存在辅助作用，为后续体内实验微血管、淋巴管新生和脉管侵袭干预机制研究提供借鉴。