类风湿关节炎患者Ⅰ类干扰素效应基因表达的应用价值

黄建军,冯 钢,李 志,程 龙,张 鹏,李小宁,浦 春

(皖南医学院第一附属医院 弋矶山医院 1.检验科；2.风湿免疫科，安徽 芜湖 241001)

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)发病机制复杂，免疫细胞在多种细胞因子的联合作用下产生自身免疫倾向，多因素诱发自身免疫性疾病[1-2]。Ⅰ类干扰素(Interferon，IFN)能够诱发系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)发病，在RA发病过程中的作用还有待深入研究，本研究以不同病程RA患者为研究对象，探讨IFN在RA发病机制中的作用。

1 资料与方法

1.1 研究对象 收集2015～2016年弋矶山医院32例RA患者临床资料，所有患者经临床确诊并符合2010年欧盟/美国抗类风湿病学会修订标准[3]，均为首次就诊或未使用改变病情抗风湿药。男7例，女25例，年龄(47±12.6)岁，RA患者病情评价(DAS28 评分) (5.3±1.7)分，住院时间(11±3.6)d，治疗方法DMARDs单药或联合疗法。收集同期32例健康体检者为正常对照组，排除自身免疫性疾病、肿瘤和感染性疾病(HBV、HCV和HIV)患者，男7例，女25例，年龄(46±10.4)岁。

1.2 RNA提取和cDNA合成 采用Takara RNAiso Blood 试剂盒提取外周血单个核细胞mRNA，PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Takara)试剂盒合成cDNA，步骤参照试剂盒方案，OD260/OD280比值均在1.7～2.1范围内。

1.3 qPCR测定 引物和探针由Invitrogen公司设计并合成，使用Premix Ex TaqTM(Takara)qPCR试剂盒，检测仪器为Lightcycler480(Roche)，反应体系25 μL，内参基因为HPRT。采用绝对定量法计算拷贝数，标准品制备方法：挑选若干cDNA含量高的样本进行靶基因和内参基因扩增实验，选择靶基因和内参基因Ct值均最小的标本为标准品，进行3倍梯度稀释，原倍标本浓度设定为27，则标准品浓度依次为27、9、3、1，以此为qPCR标准品。

1.4 血清学标志物检测 采用ELISA法检测抗CCP抗体，试剂盒由上海科新生物提供，实验步骤参照说明书。同时检测患者其他血清学标志物如C-反应蛋白(CRP)、类风湿因子(RF)等，方法采用免疫比浊法，检测平台为日立7600全自动生化分析仪。

2 结果

2.1 mRNA表达分析

2.1.1 IFN效应基因 免疫调节效应中受IFN调控的基因称为IFN效应基因，本研究主要检测了Ⅰ类IFN效应基因MXA、MXB、IFIT1、IFIT2、ISG15、HERC5、Ly6E、RSAD2、EPSTRI1、IFI44L、IFI35和IFI6基因mRNA的表达，以HPRT为内参基因，各基因引物序列见表1。

表1 qPCR各基因引物序列

基因正向引物反向引物IFIT1gat gta tta cca cat ggg cag atag cgg aag gga ttt gaa agIFIT2atc ccc cat cgc tta tct ctcca cct caa tta atc agg cac tIFI44Ltgc taa gga gta tag cag atg acc tacca caa cat cac tct cac ttt aag aISG15gag gca gcg aac tca tct ttagc atc ttc acc gtc agg tcMXAatc cag cca cca ttc caacaa caa gtt aaa tgg tat cac aga gcMXBttc ttc aaa cac atc cat att tcacag tgg taa gtc ttt ctg cca gtEPSTRLI1ccg gag aaa tga gat aca aag aatggt gaa ccg gtt tag ctc tgRSAD2atg tga aag ccc aag gac acttt ggt ttc aaa taa cac tga ttg aHERC5ctt cca gtg aaa gta tca tca agt gcca gag caa aat gct ttg attLy6Eatc ttc ttg cca gtg ctg ctgct tca gga agt aca gat tgcIFI6tgc ttc tct tct ctc ctc caagct ctc cga gca ctt ttt cttIFI35caa aag gag cac acg atc aaact caa ctg gct gga cat catHPRTtga cct tga ttt att ttg cat acccga gca aga cgt tca gtc ct

2.1.2 mRNA表达 RA组患者IFIT1、ISG15、HERC5、MXA、MXB、Ly6E和RSAD2的mRNA表达水平治疗前均高于治疗后(P<0.05)，治疗前RA组的IFIT2、ISG15、HERC5、MXA、MXB、Ly6E、RSAD2、EPSTRLI1和IFI35的mRNA表达水平均高于正常对照组(P<0.05)，治疗后RA组的ISG15、HERC5、RSAD2的mRNA表达水平均高于正常对照组(P<0.05)，其他差异无统计学意义，见表2。

2.2 抗CCP抗体和RF与IFN效应基因相关性 由于正常对照组抗CCP抗体和RF水平接近0，所以本研究仅分析了治疗前RA组患者的相关性。IIFI6、IFIT2、IFI35、MXB、Ly6E、和MXA的mRNA表达水平与治疗前RA组患者外周血RF水平呈正相关性(r=0.362～0.579，P<0.05)，IFI6、IFIT2、IFI35、ISG15、MXB、Ly6E、EPSTRI1和MXA mRNA表达水平与治疗前RA组患者外周血抗CCP抗体水平呈正相关性(r=0.354～0.667，P<0.05)，见表3。

表2 qPCR mRNA表达水平组间比较

基因治疗前RA组治疗后RA组正常对照组FPIFIT14.6±1.7b3.5±1.4a3.9±1.3ab4.0780.022IFIT23.1±1.3b2.7±0.9ab2.2±0.7a5.7500.005ISG158.6±3.5c6.9±1.8b4.6±1.4a23.4520.000HERC56.0±1.7c5.1±1.5b3.0±1.3a31.4630.000MXA6.4±3.0b5.1±1.7a4.7±1.3a5.1340.009MXB5.0±1.8b4.2±1.6a3.9±1.2a4.0660.022Ly6E3.6±1.6b2.8±1.1a2.6±0.8a6.5120.003RSAD23.3±1.4c2.6±1.0b1.8±0.8a14.3550.000EPSTRLI15.1±2.3b4.5±2.0ba3.7±1.6a3.4050.040IFI44L2.5±0.82.1±0.82.3±0.72.2150.118IFI64.4±1.93.9±1.93.8±1.41.4270.248IFI355.0±1.9b4.6±1.7ab3.9±1.6a3.7250.030

注：多组间两两比较，符号完全不同表示P<0.05。

表3 抗CCP抗体和RF与效应基因mRNA表达水平相关性

mRNA表达水平IFI44LIFI6IFIT1IFIT2IFI35ISG15MXBLy6ERSAD2HERC5EPSTRI1MXA抗CCP0.2950.635-0.1670.4280.6670.3760.3540.6500.1930.1820.5120.6190.1020.0000.3600.0150.0000.0340.0470.0000.2890.3190.0030.000RF0.0570.501-0.0010.3620.5210.2980.4120.5790.1820.1490.3400.5100.7550.0040.9960.0420.0020.0980.0190.0010.3180.4150.0570.003

注：①上层数据为相关系数r，下层为双尾P值。②为了减小治疗对抗体和基因表达水平的影响，本研究只分析治疗前RA组患者指标间相关性，n=32。

3 讨论

IFN主要由活化的浆细胞样树突状细胞合成分泌[4]，具有广谱抗病毒和免疫调节功能。IFN与SLE炎性病变的反复发作及慢性化有关[5]，有报道IFN生物学效应相关基因在RA患者人群中有高水平表达，认为RA自身免疫的发病与IFN效应基因表达相关[6]。慢性病毒感染可能是RA发病的触发因素，发病机制可能与病毒感染产生的抗原交叉反应相关[7]。我们检测了IFN抗病毒效应基因MXA和MXB的表达水平，MXA蛋白抗病毒谱广泛，通过水解核糖蛋白体中的核衣壳裂解病毒，释放出病毒核酸被胞质中的核酸内切酶降解[8]，MXB功能不详。MXA mRNA表达水平在治疗前RA升高，治疗后降低，与对照组处于同一水平；MXB mRNA表达水平在正常对照、治疗后和治疗前RA组呈现逐渐上升的趋势，表明MXA和MXB的表达与RA的病情相关，表达增高与病情加重相关。IFIT1和IFIT2主要功能是抑制病毒复制[9]，参与调控非折叠蛋白反应和细胞凋亡[10-11]。ISG15和HERC5能通过泛素化反应清除细胞局部无效蛋白分子，促进IFN效应基因的表达[12-13]。IFI6和IFI35参与淋巴细胞凋亡调节[14]，EPSTRI1与上皮细胞转化相关，IFI44L参与IFN诱导的多种生物学功能如抗病毒、抑制增殖活性等[15]。IFI6可以通过抑制细胞凋亡蛋白酶3和细胞凋亡蛋白酶9来抑制细胞凋亡，IFI35作用机制不详[16]。RA以关节局部组织炎症细胞浸润和B淋巴细胞持续分泌自身抗体为特征，炎症细胞和B淋巴细胞凋亡受阻将加重RA的炎症反应，使病情持续反复。我们的研究发现，IFIT1和IFIT2的mRNA在治疗前RA组增高，表明RA患者由IFIT1和IFIT2控制的基因转录水平的调控更加活跃，与IFN相关的转录调控在RA发病过程中可能起重要作用，随着病情活跃度的升高，ISG15和HERC5 mRNA表达也增高；以上结果表明IFN效应基因的生物学活性随着RA病情活动度加重而增强。我们的研究结果显示INF更倾向于通过诱导IFI35蛋白来抑制巨噬细胞、成纤维细胞和上皮细胞的凋亡进而影响RA病情，但IFN效应基因的作用机制有待进一步研究。

Ly6E和RSAD2是B淋巴细胞增殖和扩增的重要调节基因[17]，通过TGF-β介导调节B淋巴细胞扩增，RSAD2促进Th0细胞向Th2细胞分化，进而诱导和调节B淋巴细胞活化和自身抗体分泌[18]。Ly6E和RSAD2在治疗前RA组的表达水平高于治疗后RA组和对照组，表明RA患者由IFN诱导的Th2辅助细胞和B淋巴细胞活性增强，加重体液型自身免疫反应对机体的损伤。

为了进一步明确INF的效应与自身抗体产生的关系，我们分析了IFN效应基因与抗CCP抗体和RF之间的关联性。结果显示，多个基因(IFI6、IFI35、ISG15、EPSTRI1、Ly6E、IFIT2、MXA和MXB)mRNA表达与RA自身抗体水平呈正相关，表明IFI6、IFI35、ISG15、EPSTRI1、Ly6E、IFIT2和MXA的表达可能促进RA自身抗体的产生。与我们的结果相反，Cantaert等[19]在RA患者中的研究认为INF对自身抗体的产生没有作用。Cantaert的RA患者经过阿达木单抗治疗，近期有研究证实阿达木单抗能够改变INF对中性粒细胞的作用[20]，所以有理由认为其他炎症细胞也有可能因阿达木单抗药物影响INF的生物学效应，相关结果还需进一步证实。

本研究为IFN效应基因在RA发病过程中的作用提供了一定的证据，多种效应基因的表达在RA人群中升高，并且表达升高与自身抗体的产生有正相关性。

【参考文献】

[1] SCOTT DL,WOLFE F,HUIZINGA TW.Rheumatoid arthritis[J].Lancet,2010,376(9746):1094-1108.

[2] CHRISTMANN RB,SAMPAIO-BARROS P,STIFANO G,etal.Association of interferon-and transforming growth factor beta-regulated genes and macrophage activation with systemic sclerosisrelated progressive lung fibrosis[J].Arthritis Rheumatol，2014,66(3):714-725.

[3] ALETAHA D,NEOGI T,SILMAN AJ,etal.2010 Rheumatoid arthritis classification criteria:an American college of rheumatology/European league against rheumatism collaborative initiative[J].Arthritis Rheum,2010,62(9):2569-2581.

[4] CAO W,LIU YJ.Innate immune functions of plasmacytoid dendritic cells[J].Curr Opin Immunol,2007,19(1):24-30.

[5] BLOMBERG S,ELORANTA ML,CEDERBLAD B.Presence of cutaneous interferon-alpha producing cells in patients with systemic lupus erythematosus[J].Lupus,2001,10(7):484-490.

[6] VAN DER POUW KRAAN TC,WIJBRANDTS CA,VAN BAARSEN LG,etal.Rheumatoid arthritis subtypes identified by genomic profiling of peripheral blood cells:assignment of a type I interferon signature in a subpopulation of patients[J].Ann Rheum Dis,2007,66(8):1008-1014.

[7] WESTERGAARD MW,DRABORG AH,TROELSEN L,etal.Isotypes of Epstein-Barr virus antibodies in rheumatoid arthritis:association with rheumatoid factors and citrulline dependent antibodies[J].Biomed Res Int,2015(2015):472174.

[8] HALLER O,STAEHELI P,SCHWEMMLE M,etal.Mx GTPases:dynamin-like antiviral machines of innate immunity[J].Trends Microbiol,2015,23(3):154-163.

[9] ZHOU X,MICHAL JJ,ZHANG L,etal.Interferon induced IFIT family genes in host antiviral defense[J].Int J Biol Sci,2013,9(2):200-208.

[10] CLAVARINO G,ADRIOUACH S,QUESADA JL,etal.Unfolded protein response gene GADD34 is overexpressed in rheumatoid arthritis and related to the presence of circulating anti-citrullinated protein antibodies[J].Autoimmunity,2016,49(3):172-178.

[11] LAI KC,CHANG KW,LIU CJ,etal.IFN induced protein with tetratricopeptide repeats 2 inhibits migration activity and increases survivalof oral squamous cell carcinoma[J].Mol Cancer Res,2008,6(9):1431-1439.

[12] FENSTERL V,SEN GC.The ISG56/IFIT1 gene family[J].J Interferon Cytokine Res,2011,31(1):71-78.

[13] ZHANG L,HAPON MB,GOYENECHE AA,etal.Mifepristone increases mRNA translation rate,triggers the unfolded protein response,increases autophagic flux,and kills ovarian cancer cells in combination with proteasome or lysosome inhibitors[J].Mol Oncol,2016,10(7):1099-1117.

[14] YANG W,TAN J,LIU R,etal.Interferon-gamma upregulates expression of IFP35 gene in HeLa cells via interferon regulatory factor-1[J].PLoS One,2012,7(12):e50932.

[15] CHERIYATH V,GLASER KB,WARING JF,etal.G1P3,an IFN-induced survival factor,antagonizes TRAIL-induced apoptosis in human myeloma cells[J].J Clin Invest,2007,117(10):3107.

[16] QI Y,LI Y,ZHANG Y,etal.IFI6 inhibits apoptosis via mitochondrial dependent pathway in dengue virus 2 infected vascular endothelial cells[J].PLoS One,2015,10(8):e0132743.

[17] 汤建平,顾越英,沈南,等.干扰素诱导表达的淋巴细胞抗原6复合体E和干扰素诱导蛋白1基因与系统性红斑狼疮患者病情活动性的关系[J].中华医学杂志,2004,84(14):1157-1160.

[18] ALHOSSINY M,LUO L,FRAZIER WR,etal.Ly6E/K signaling to TGFbeta promotes breast cancer progression,immune escape,and drug resistance[J].Cancer Res,2016,76(11):3376-3386.

[19] CANTAERT T,VAN BAARSEN LG,WIJBRANDTS CA,etal.Type I interferons have no major influence on humoral autoimmunity in rheumatoid arthritis[J].Rheumatology,2010,49(1):156-166.

[20] WRIGHT HL,THOMAS HB,MOOTS RJ,etal.Interferon gene expression signature in rheumatoid arthritis neutrophils correlates with a good response to TNFi therapy[J].Rheumatology,2015,54(1):188-193.