ALDH1A3和CD133在皮肤鳞状细胞癌中的表达及其临床意义

陈 雷,吕大伦,刘雯蓓,丁 伟,张 炜,王合丽,王 帅

(皖南医学院第一附属医院 弋矶山医院 1.烧伤整形外科;2.皮肤性病科,安徽 芜湖 241001)

皮肤鳞状细胞癌(cutaneous squamous cell carcinomas，SCC)又名棘细胞癌(pricklecell carcinoma)，起源于皮肤中角质层。主要好发于长期暴露、易接触理化因素刺激部位，如头部、面颈部和手背等，且以老年患者居多。在我国皮肤肿瘤中SCC发生率最高，因其肿瘤特性，早期往往没有引起患者的足够重视，以致确诊时部分患者已发生淋巴及血性转移。目前SCC发生机制尚不十分清楚，因此研究该病的发病机制并寻找出可以提高早期诊断率的方法是控制此类疾病的关键。我科采用免疫组化法对SCC和正常皮肤组织中ALDH1A3和CD133表达进行检测，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 收集我院2012～2016年手术切除34例皮肤鳞癌组织蜡块标本，患者年龄47～80岁，平均(67±9)岁，部位：头顶部18例、面部8例、足部6例、其他部位2例。病理：Ⅰ级鳞癌(高分化)18例、Ⅱ级鳞癌(中分化)15例、Ⅲ级鳞癌(低分化)1例。11例美容手术切除标本，患者年龄20～31岁，平均(25±3)岁，部位：全部为双眼皮成形术切除的上睑皮肤组织。

1.2 方法 通过收集皮肤鳞状细胞癌肿瘤组织蜡块，采用免疫组化法进行ALDH1A3和CD133表达的检验，同时收集整形手术中获取的正常皮肤组织ALDH1A3和CD133表达作阴性对照进行检测，并且我们还切取部分乳腺癌瘤体组织作为阳性对照。免疫组化法步骤如下:①切片常规脱蜡、水化;②预处理组织切片;③PBS冲洗，2 分钟/次，共冲洗3次;④一抗孵育30 min或60 min;⑤PBS冲洗，2 分钟/次，共冲洗3次;⑥PicTure-Plus；液孵育15～30 min;⑦PBS冲洗，2 分钟/次，共冲洗3次;⑧DAB染色，光镜下控制时间;⑨蒸馏水漂洗;⑩复染及封片。

1.3 统计学方法 采用SPSS 18.0进行统计学处理。计数资料采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

在高倍镜下(400×)每张切片随机选取5个视野(每个视野200个细胞)，计数正常上皮组织细胞及皮肤鳞状细胞癌组织中的肿瘤细胞，统计阳性细胞所占的百分数，并按如下分级:阳性细胞数>10%则视为阳性表达；>50%为;30%～50%为;10%～30%为+;<10%为阴性表达。本次研究中ALDH1A3在SCC组织中阳性表达率为73.52% (25/34)(见图1A、表1)，CD133在SCC组织中阳性表达率为79.41%(27/34)(见图1B、表1)。ALDH1A3在正常皮肤中阳性表达率为18.18% (2/11)(见图1C、表2)，CD133在正常皮肤中阳性表达率为9.09%(1/11)(见图1D、表2)。对两种蛋白在正常组织及鳞癌组织中阳性率的比较可见：ALDH1A3和CD133在SCC组织中的阳性表达均高于正常组织，ALDH1A3：χ2=8.43、CD133：χ2=14.62，差异具有统计学意义(P<0.01)。对三级鳞癌分组中ALDH1A3和CD133表达情况进行gamma值计算，两组gamma值均>0，ALDH1A3：G =0.7、CD133：G =0.694由此可知ALDH1A3和CD133在癌细胞中表达与SCC恶性程度成正相关。

表1 ALDH1A3在正常组织及不同级别鳞癌中表达情况

组别nALDH1A3-+阳性率/%正常组织11920018.18Ⅰ级鳞癌18683166.67Ⅱ级鳞癌15345380.00Ⅲ级鳞癌10001100

表2 CD133在正常组织及不同级别鳞癌中表达情况

组别nCD133-+阳性率/%正常组织11101009.09Ⅰ级鳞癌18485177.78Ⅱ级鳞癌15346280.00Ⅲ级鳞癌10001100

A.ALDH1A3在皮肤鳞状细胞癌组织中表达;B.CD133在皮肤鳞状细胞癌组织中表达;C.ALDH1A3在正常皮肤组织中表达;D.CD133在正常皮肤组织中表达;E.ALDH1A3在乳腺癌癌组织中表达;F.CD133在乳腺癌癌组织中表达。

图1 ALDH1A3和CD133在正常皮肤组织及癌组织的表达

3 讨论

3.1 SCC起源于表皮或附属器角质形成细胞，世界范围内发病率仅低于基底细胞癌(basal cell carcinoma，BCC)的非黑色素瘤(non melanoma)类恶性肿瘤，并且我国发病率较高。相对于基底细胞癌而言，SCC在非黑色素瘤皮肤癌发病率中约占20%。SCC有着极强的恶性趋势，转移率较高，而且近年来SCC患病人数在逐年增长[1]。研究SCC的发生机理和寻求提高早期诊断成功率的方法具有重要的临床意义。

3.2 跨膜糖蛋白CD133和乙醛脱氢酶ALDH1A3作为肿瘤干细胞标志物的重要性被越来越多的学者所熟知[2-4]。CD133蛋白基因位于4号染色体，由865个氨基酸组成。2003年首次被学者报道发现于脑肿瘤干细胞表面，在研究中发现在CD133(+)的脑肿瘤干细胞中，肿瘤的自我更新能力尤为突出。此后陆续有学者报道CD133被发现于卵巢癌、前列腺癌、肝癌、结肠癌的干细胞中，并且在大鼠的动物实验中显示CD133(+)组比CD133(-)组的肿瘤干细胞具有更强大的增殖、克隆能力[5]。后Patel发现CD133在皮肤鳞状细胞癌中也存在异常高表达，并且CD133表达程度与肿瘤的分化、预后密切相关[6]。由此可推断CD133对于皮肤鳞状细胞癌的发生、发展起到重要作用，可能为其特异性肿瘤标志物。ALDH1A3是ALDH家族的成员，ALDH是参与细胞内的维甲酸生产的酶[7]。维甲酸在细胞分化过程及干细胞对机体自我保护中起重要作用[8]。已发现在多发性骨髓瘤和急性髓系白血病肿瘤干细胞中ALDH1A3高表达[9]。在人类乳腺癌细胞中ALDH1A3是特异性肿瘤标记物，其表达情况与乳腺癌患者预后相关[10]。同时ALDH1A3的表达情况也可以作为肺肿瘤分级的指标，并且随着表达等级的提高，肺癌患者预后也随之越差[11]。此外，最新报道显示ALDHA3也被证明是前列腺肿瘤干细胞特异标记物[12]。ALDHA3是众多肿瘤的特异性标记物，但其在人皮肤鳞状细胞癌组织中表达国内外鲜有报道。

3.3 ALDH1A3和CD133已被证明是众多肿瘤细胞特异性标记物，并且CD133在SCC的发生、发展中起到重要作用，同时ALDH1A3和CD133与肿瘤分级、转移、愈后等密切相关。由本实验数据可知ALDH1A3和CD133在SCC组织的中阳性表达率为73.52%和79.41%，ALDH1A3和CD133在正常皮肤组织中的阳性表达率分别为18.18%和9.09%。ALDH1A3和CD133在SCC组织中的阳性表达高于正常皮肤组织，并且采用同样方法将乳腺癌组织ALDH1A3和CD133的表达做阳性对照(见图1E、F)。从而推断ALDH1A3和CD133可能是SCC肿瘤干细胞特异性标记物，并可作为SCC诊断参考的重要指标。另外本研究发现，鳞癌分级越高(恶性程度越高)，ALDH1A3和CD133的表达水平也随之升高，对两组等级变量进行gamma分析得出鳞癌分级与ALDH1A3和CD133的表达呈正相关，且通过术后回访1例SCC复发病人的免疫组化结果也显示出ALDH1A3和CD133呈强阳性的表达，说明ALDH1A3和CD133表达与SCC的分级呈正相关，具体作用机制有待进一步研究。

目前国内外对于ALDH1A3和CD133在SCC中表达的研究报道很少见。本研究通过免疫组化法对SCC和正常皮肤组织中ALDH1A3和CD133表达进行检测，旨在证明ALDH1A3和CD133可以作为SCC特异性标志物。同时我们对皮肤鳞癌相关lncRNA研究也在同步进行，或许将来在皮肤鳞状细胞癌的诊断、分级和愈后中ALDH1A3和CD133都可以作为重要指标。

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