黄酮水杨酸衍生物的合成及抗肿瘤活性测定

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(1.南华大学药物药理研究所，湖南省分子靶标新药研究协同创新中心，湖南 衡阳 421001；2.株洲市二医院药剂科)

黄酮是一种广泛存在自然界中的多酚类化合物，具有广泛的生物活性，如抗肿瘤，抗氧化，抗炎，抗菌等作用[1-4]。醋酸黄酮是最早的肿瘤血管阻断剂[5]。目前，许多正在临床试验的肿瘤血管破坏剂结构中都具有苯三甲氧基基团(图1)，如CA4P及其类似物OXi4503和AVE8062[6-8]，秋水仙碱类似物ZD6126[9], BNC-105[10]和CKD-516[11]，苯三甲氧基团对肿瘤药物设计具有重要的研究价值。

众所周知的抗炎药物-乙酰水杨酸和水杨酸也显示出较好的抗肿瘤活性[12-13]。基于上述考虑，本文作者提出将苯三甲氧基和水杨酸及其衍生物引入黄酮骨架，进行结构修饰和衍生化，合成了一系列含有苯三甲氧基的水杨酸黄酮衍生物和白杨素水杨酸衍生物，并初步评价其抗肿瘤活性，寻找具有高效低毒的新型抗肿瘤候选药物。

图1 CA4P，OXi4503，AVE8062，ZD6126，BNC-105和CKD-516的结构

1 材料与方法

1.1仪器Thermo Scientific Electrothermal Digital熔点测定仪，Bruker AV-400型光谱仪，Waters GCT质谱仪，WellscanMK-2酶标仪。

1.2材料3,4,5-三甲氧基苯酚(98%)、对羟基苯甲醛(98%)、氯乙腈(98%)、白杨素(98%)、4-氯水杨酸(98%)、5-氯水杨酸(98%)购于阿拉丁试剂；胎牛血清FBS、RPMI-1640培养基、DMEM培养基(Gibco公司)；柱层析硅胶板(安徽跃化硅材料有限公司)；其他试剂均为市售分析纯。

1.3方法

1.3.1 5,6,7-三甲氧基-4′-羟基黄酮(2)的合成 如图2所示。将3,4,5-三甲氧基苯酚(2.208 g,12 mmol)置于150 mL的三颈瓶中，加入氯仿-无水乙醚(1∶1)40 mL，冰浴冷却，原料溶解完全后加入氯乙腈(1.5 mL,24 mmol)与无水氯化锌(0.326 4 g,2.4 mmol)，充分混匀，通入干燥氯化氢，3 h后将反应瓶4 ℃放置1天，再通氯化氢2 h，4 ℃放置1天，倾出氯仿-无水乙醚，过滤，氯仿-无水乙醚洗涤淡黄色沉淀，适量热水将洗涤后的淡黄色沉淀溶解于圆底烧瓶中，水浴加热回流1 h，4 ℃静置过夜，抽滤，即得到化合物2′-羟基-4′,5′,6′-三甲氧基-2-氯苯乙酮(1)。

将化合物1(10 mmol)与对羟基苯甲醛(11 mmol)混合，加入5 mL 95%乙醇溶解，摇匀，慢慢加入2.5 mL 10%NaOH，室温下搅拌2天，用10%HCl调节pH至有亮黄色沉淀析出，抽滤，沉淀用无水乙醇溶解，缓慢滴加蒸馏水直至有结晶出现，静置过滤即得到化合物2。

1.3.2 化合物4a和4b的合成 如图3所示。将5-氯水杨酸(5 mmol)溶解于15 mL蒸馏水中，37 ℃水浴加热，用30% NaOH调节溶液pH为10，搅拌30 min，缓慢滴加2 mL硫酸二甲酯，若反应液pH变为中性，用30%NaOH调节溶液pH为10，反应1～2 h，TLC监测反应进程(展开剂为二氯甲烷：甲醇 10∶1)，若反应未完全则重复上述步骤，反应完全则在80 ℃水浴条件下水解15 min，冷却至室温，10% HCl调节pH为5，有白色沉淀生成，蒸馏水洗涤沉淀，将沉淀真空干燥；将干燥后的沉淀溶于10 mL二氯甲烷，加入两滴DMF(N,N-二甲基甲酰胺)和0.5 mL氯化亚砜，40 ℃油浴加热回流0.5 h，减压蒸除二氯甲烷和氯化亚砜，得化合物4a。

化合物4b与化合物 4a合成方法类似。

图2 5,6,7-三甲氧基-4′-羟基黄酮(2)的合成路线

图3 化合物4a和4b的合成路线

1.3.3 目标化合物5a、5b、6a和6b的合成 化合物4a(5 mmol)用15 mL丙酮溶解，加入化合物2(7 mmol)，滴加1 mL三乙胺，反应2 h，反应完全后减压蒸干丙酮，硅胶柱分离纯化得到5a，洗脱剂为二氯甲烷。如图4所示。

化合物5b与化合物5a合成方法类似。合成的化合物由核磁共振氢谱和质谱来确认。化合物4a(5 mmol)用15 mL丙酮溶解，加入白杨素(7 mmol)，滴加1 mL三乙胺，反应2 h，反应完全后减压蒸干丙酮，硅胶柱分离纯化6a，洗脱剂为二氯甲烷。化合物6b与化合物6a合成方法类似。合成的化合物由核磁共振氢谱和质谱来确认。

图4 目标化合物5a、5b、6a和6b的合成路线

1.3.4 抗肿瘤活性测定 采用MTT法研究化合物2，5a，5b，6a，6b，白杨素对胃癌细胞MGC-803、乳腺癌细胞MCF-7和肝癌细胞HepG-2的体外抗肿瘤活性，以5-氟尿嘧啶作为阳性对照。胃癌细胞MGC-803培养在含10%胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培养基中，乳腺癌细胞MCF-7和肝癌细胞HepG-2培养在含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培养基中。细胞均在37 ℃，5% CO2及90%湿度条件下培育。取对数生长期的肿瘤细胞接种于96孔板，接种密度为8×103/孔，24 h后用不同浓度(256，128，64，32，16，8，4，2 μmol/L)的化合物进行处理。48 h后，每孔加入20 μL的MTT溶液(5 mg/mL)。4 h后，每个孔加入150 μL的DMSO溶解晶体，并在490 nm处测量吸光度。50%细胞的抑制浓度(IC50)是由Logit法测定的。所有实验均操作3次。

2 结 果

2.1目标化合物的表征5,6,7-三甲氧基-4′-羟基黄酮(2)：金黄色粉末，产率：36%，熔点：194-195 ℃。1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ 7.78(d, J=8.4 Hz, 2H), 6.88(d, J=8.5 Hz, 2H), 6.73(s, 1H), 6.53(s, 1H), 5.11(s, 1H), 4.24(s, 3H), 3.96(s, 3H), 3.81(s, 3H). MS(ESI): 329.1(C18H16O, [M+H+])。

(5,6,7-三甲氧基-4-氧代-4H-苯并吡喃-2-基)苯基5-氯-2-甲氧基苯甲酸甲酯(5a)：黄色粉末，产率：71%，熔点：133～135 ℃。1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ 7.93(s，1H)，7.83(t，J=12.9 Hz，2H)，7.43(t，J=10.5 Hz，1H)，7.20(d，J=7.3 Hz，2H)，6.92(d，J=8.9 Hz，1H)，6.72(d，J=20.0 Hz，1H)，6.49(s，1H)，4.31-4.09(m，3H)，3.87(t，J=19.9 Hz，6H)，3.72(d，J=27.4 Hz，3H). MS(ESI):498.1(C26H21O8Cl，[M+H+])。

(5,6,7-三甲氧基-4-氧代-4H-苯并吡喃-2-基)苯基4-氯-2-甲氧基苯甲酸甲酯(5b)：黄色粉末，产率：69%，熔点：144～151 ℃。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ 7.98(d，J=8.7 Hz，1H)，7.90(d，J=8.7 Hz，2H)，7.27(d，J=8.7 Hz，2H)，7.06-7.02(m，2H)，6.76(s，1H)，6.54(s，1H)，4.25(s，3H)，3.97(s，3H)，3.94(s，3H)，3.81(s，3H). MS(ESI): 498.1(C26H21O8Cl，[M+H+])。

5-羟基-4-氧代-2-苯基-4H-苯并吡喃-7-基5-氯-2-甲氧基苯甲酸甲酯(6a)：浅黄色粉末，产率：78%，熔点：198-198.5 ℃。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ 12.74(s，1H)，7.97(d，J=2.7 Hz，1H)，7.91-7.87(m，2H)，7.57-7.49(m，4H)，6.99(dd，J=5.5，3.5 Hz，2H)，6.74(s，1H)，6.69(d，J=2.0 Hz，1H)，3.94(s，3H). MS(ESI):507.4(C23H15O5Cl，[M+H+])。

5-羟基-4-氧代-2-苯基-4H-苯并吡喃-7-基4-氯-2-甲氧基苯甲酸酯(6b)：浅黄色粉末，产率：80%，熔点：194-195 ℃。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ 12.77(s，1H)，8.21(dd，J=7.9，1.6 Hz，1H)，7.89(dd，J=8.1，1.6 Hz，2H)，7.70-7.64(m，1H)，7.54(dd，J=6.9，4.6 Hz，2H)，7.41(td，J=7.8，1.1 Hz，1H)，7.20-7.17(m，1H)，6.93(d，J=2.1 Hz，1H)，6.74(s，1H)，6.66(d，J=2.1 Hz，1H)，2.32(s，3H). MS(ESI): 407.4(C23H15O5Cl，[M+H+])。

2.2抗肿瘤活性表1为化合物2、5a、5b、6a、6b和白杨素的抗肿瘤活性，以5-氟尿嘧啶为阳性对照。化合物对胃癌细胞MGC-803、乳腺癌细胞MCF-7和肝癌细胞HepG-2均有较好的抗肿瘤活性，其中对胃癌细胞MGC-803整体的抗肿瘤活性优于其它两种癌细胞。化合物2、5a、5b、6a、6b对胃癌细胞MGC-803的抗肿瘤活性优于白杨素与阳性对照药5-氟尿嘧啶，其中5b的抗肿瘤活性为21.59±5.75 μmol/L。

表1 化合物对肿瘤细胞体外抗活性的测定

3 讨 论

癌症目前已经成为了一个全球性难以治疗的疾病。常见的胃癌、乳腺癌和肝癌为我国排名前五的恶性肿瘤，由癌症造成的死亡已连续多年占据我国居民死亡原因的首位。

近年来，黄酮类化合物及其衍生物的抗肿瘤活性研究引起了人们的广泛关注，但由于其溶解性差，生物利用度低，无靶向作用等原因限制了其在临床方面的应用。因此，通过对黄酮类化合物的结构修饰和衍生化来解决上述问题，对筛选出高效低毒的抗肿瘤靶向药物具有重要意义。

以3,4,5-三甲氧基苯酚为原料，通过Friedel-Crafts反应合成2′-羟基-4′,5′,6′-三甲氧基-2-氯苯乙酮(1)，然后通过改进后的Baker-Venkataraman 重排反应合成5,6,7-三甲氧基-4′-羟基黄酮(2)。水杨酸衍生物完成甲基化反应和酰氯化反应后，与化合物2和白杨素发生酯化反应得到目标化合物5a、5b、6a、6b。体外抗肿瘤活性实验结果表明，具有苯三甲氧基基团的化合物2及其衍生物5a、5b的抗肿瘤活性优于白杨素及其衍生物6a、6b，说明黄酮骨架引入苯三甲氧基基团在一定程度上能增强其抗肿瘤活性。其中5b表现出较好的抗肿瘤活性，可进一步研究其抗肿瘤活性与作用机制。

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