STGC3基因高表达对CNE2细胞放疗敏感性的影响

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(南华大学肿瘤研究所，湖南 衡阳 421001)

鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma,NPC)是一种起源于鼻咽黏膜上皮细胞的恶性肿瘤，其高发人群主要分布于我国南方、香港、东南亚等地区[1]。其组织学特性以及解剖部位特点决定了放射治疗是鼻咽癌的首选治疗方式。然而，放疗所产生的副作用以及因放疗抵抗而导致部分病人治疗失败的问题依然存在，因此，探寻提高放疗敏感性的策略及分子机制将有助于提高鼻咽癌患者放射治疗效果。

自噬是真核细胞中一种进化上高度保守的溶酶体依赖性降解途径。在能量缺乏，缺氧等应激压力下，细胞可以通过自噬，将受损的蛋白质及细胞器降解，最终产物可以释放进入胞浆，重新供给细胞利用，从而维持细胞生存以及内环境稳态。研究表明，放疗可以诱导肿瘤自噬，且自噬水平增高是肿瘤细胞放疗抵抗的机制之一[2-3]。

STGC3基因是本课题组成员所克隆的一个鼻咽癌相关候选抑癌基因[4]，前期研究表明，在鼻咽癌细胞和组织中，STGC3基因的表达下调或缺失。恢复STGC3基因在鼻咽癌CNE2细胞的表达，CNE2细胞生长增殖、体外成瘤能力均下降[5-6]。然而，其确切的功能及作用机制仍有待阐明，因此，本文拟通过构建STGC3基因高表达的CNE2细胞系，初步探讨STGC3基因高表达对CNE2细胞放疗敏感性的影响及其可能的机制。

1 材料与方法

1.1材料STGC3基因稳定高表达CNE2细胞系(CNE2-RTP-hSTGC3-his)以及转染空载体CNE2的细胞系(CNE2-RTP-his)已由本课题组成员前期构建完成，并保存于本研究所-80 ℃超低温冰箱。RPMI-1640购自Hyclone公司；小牛血清购自杭州四季青公司；LC3、SQSTM1/p62兔抗人单克隆抗体均购自CST公司；SFN鼠抗人单克隆抗体购自Abcam公司；SDS-PAGE凝胶试剂盒、RIPA裂解液(强)、蛋白质上样缓冲液、考马斯亮蓝常规染色试剂盒均购自北京康为世纪公司；CCK-8试剂购自Dojindo。

1.2稳定转染细胞系的鉴定与分组复苏CNE2、CNE2-RTP-his、CNE2-RTP-hSTGC3-his三组细胞，分别设置为空白对照组、阴性对照组、实验组。将各组细胞置于含10%小牛血清培养基中，于37 ℃，5%CO2培养箱培养。待细胞生长密度达到80%时，置于荧光显微镜下拍照。Western blot检测各组细胞中STGC3蛋白的表达。按常规方法，加入RIPA裂解液，充分裂解后，于4 ℃，12 000 rpm，离心15 min，收集上清液。将收集的样品与蛋白上样缓冲液以4∶1的比例，100 ℃煮沸5 min。煮沸后的样品经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)凝胶电泳后，电转至PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温封闭2 h。随后加入兔抗人STGC3多克隆抗体，4 ℃孵育过夜。TBST液洗膜3次，10 min/次，加入羊抗兔荧光二抗，暗处室温孵育2 h。再次用TBST液洗膜3次，10 min/次。近红外双荧光扫描仪显影。

1.3细胞照射各组细胞生长密度约为80%时，X线照射细胞。每组细胞设置3个平行样本。照射条件：室温条件下，6 MV X线照射细胞，总剂量为4Gy(剂量率为200 cGy/min)，源皮距100 cm，照射野为20 cm×20 cm。培养瓶细胞贴壁面朝上，其上方垫1.5 cm组织等效补偿膜；96孔板上方垫1 cm组织等效补偿膜。

1.4 CCK-8测定细胞活力各组细胞以5×103个/孔的数量同时接种于96孔板，每组设置5个复孔。照射后4 h、24 h分别吸尽孔板内的培养基，PBS清洗3遍，更换新鲜的含10%血清培养基，100 μL/孔，同时10 μL /孔加入CCK-8溶液。37 ℃，5%CO2培养箱继续培养。测定450 nm处的OD值，评价细胞活力。

1.5质谱分析照射前后蛋白表达差异各组细胞照射前和在照射后4 h分别提取总蛋白，与蛋白上样缓冲液以4∶1的比例，100 ℃煮沸5 min。经SDS-PAGE电泳后，将凝胶用考马斯亮蓝室温染色2 h。随后脱色液脱色6 h，期间更换3次脱色液。脱色完全后，选取表达存在差异的条带，送至上海生工生物公司进行质谱分析，并通过String蛋白质相互作用预测系统(www.string-db.org， Version 10.5)对质谱分析结果进行蛋白质相互作用的预测及分析。

1.6 Western blot检测照射后蛋白表达各组细胞照射后4 h提取总蛋白，Western blot检测SFN蛋白、自噬相关蛋白LC3与SQSTM1/p62的表达。具体步骤同前。

1.7统计学处理数据经统计学SPSS16.0处理，数据均采用均数±标准差表示，组间两两比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1稳定转染STGC3高表达CNE2细胞系CNE2-RTP-hSTGC3-his的鉴定荧光显微镜下观察红色荧光蛋白(Red fluorescence protein,RFP)的表达情况，可见CNE2-RTP-his组和CNE2-RTP-hSTGC3-his组中有RFP的表达，且荧光细胞数>80%(图1)。Western blot结果显示，STGC3蛋白在实验组中表达升高(图2)。

2.2 CCK-8测定细胞活力结果X线照射后CCK-8法测定细胞活力，结果显示，与空白对照组和阴性对照组比较，照射后实验组细胞活力明显下降，差异具有统计学意义(P<0.05)(表1)。

图1 荧光显微镜下观察转染效率(200×)

图2 Western blot检测各组细胞中STGC3蛋白表达A：CNE2 B：CNE2-RTP-his C：CNE2-RTP-hSTGC3-his.与CNE2-RTP-his组比较，*P<0.05；与CNE2组比较，#P<0.05

时间CNE2(空白对照组)CNE2-RTP-his(阴性对照组)CNE2-RTP-hSTGC3-his(实验组)4h1.34±0.080.80±0.060.70±0.01a24h2.29±0.080.75±0.030.47±0.01a

与阴性对照组比较，aP<0.05

2.3蛋白质质谱分析提取照射前、后各组细胞蛋白，经SDS-PAGE电泳后，将凝胶考马斯亮蓝染色。脱色后，凝胶成像系统拍照，并根据条带颜色深浅，选取照射后表达存在差异的条带进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱质谱分析(Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry, Maldi-TOF)(图3)。若Mascot分数>43分(P<0.05)，则认为条带得到鉴定。本实验选取了3条X线照射后，颜色加深的条带，分别记为①，②，③。鉴定结果显示，①号蛋白条带为SFN(Score=44)；②号蛋白条带为TUBA1B(Score=78)；③号条带为calnexin(Score=56)(图4)，显示这三种蛋白在X线照射后表达可能增加。运用String蛋白质相互作用预测系统，显示三种筛选蛋白可通过热休克蛋白5(Heat shock protein 5, HSPA5)与自噬相关蛋白相互作用(图5)，相互作用蛋白质的信息及分值见表2。

图3 凝胶考马斯亮蓝染色黑白成像1：CNE2 2：CNE2-RTP-his 3：CNE2-RTP-hSTGC3-his.△代表细胞已经照射处理； ①、②、③为选取的表达差异条带

图4 Maldi-TOF-TOF质谱分析①SFN；②TUBA1B；③calnexin

2.4照射后自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3(Microtubule associated protein 1 light chain 3, LC3)和p62蛋白测定自噬发生时，定位于自噬体膜上的LC3-II的表达增加，而自噬特异性降解蛋白p62的表达则降低。因此，通过计算LC3-II/β-actin以及p62/β-actin的相对比值可以评价LC3-II以及p62的表达水平，同时也一定程度反映自噬的活性。Western blot结果显示，实验组中，LC3-II的表达水平较对照组降低(P<0.05)(图6)，p62的表达水平相比对照组则升高(P<0.05)(图7)。

图5 蛋白质相互作用预测网络图

Protein nameLC3A/BSFNTUBA1BSQSTM1CANXHSPA5LC3A/B0.5130.9780.458SFN0.5130.559TUBA1B0.5130.439SQSTM10.9780.579CANX0.996HSPA50.4580.5590.4390.5790.996

图6 Western blot检测LC3蛋白A：CNE2； B：CNE2-RTP-his； C：CNE2-RTP-hSTGC3-his. 与CNE2-RTP-his组比较，*P<0.05

图7 Western blot检测p62蛋白A：CNE2；B：CNE2-RTP-his；C：CNE2-RTP-hSTGC3-his. 与CNE2-RTP-his组比较，*P<0.05

2.5照射后SFN蛋白测定SFN蛋白可以通过多条途径参与自噬的调节，结合质谱分析结果与文献参考，通过检测SFN蛋白的表达水平，初步探讨STGC3基因对自噬调控的可能机制。Western blot结果显示，经X线照射后，实验组细胞中SFN蛋白的表达水平较对照组降低(P<0.05)(图8)。

图8 Western blot检测SFN蛋白A：CNE2 B：CNE2-RTP-his C：CNE2-RTP-hSTGC3-his. 与CNE2-RTP-his组比较，*p<0.05

3 讨 论

放射抗拒是临床上鼻咽癌治疗的一大障碍，寻找提高放疗敏感性的潜在机制有助于针对性地设计治疗方案，从而提高肿瘤放射治疗的效果。STGC3基因是本课题组所克隆的鼻咽癌相关候选抑癌基因(GeneBank登录号为AY078383)，该基因定位于3p21，开放阅读框为438 bp,编码一个由146个氨基酸组成，分子量为16 kD的蛋白质,定位于胞核与胞浆[4]。前期研究已经表明，STGC3基因具有抑制鼻咽癌细胞恶性表型的作用，但STGC3基因对鼻咽癌放疗的影响及可能的机制尚不明确。

本实验显示，在经过X线照射处理后，STGC3基因高表达可以降低鼻咽癌CNE2细胞的活力，初步证明STGC3基因高表达可以提高CNE2细胞对放疗的敏感性。作为一种维持细胞内稳态的重要机制，自噬广泛参与多种细胞功能，既能在代谢应激压力时保护细胞，又能因为过度活化而导致细胞发生II型程序性死亡[7]。有研究表明，肿瘤细胞可以通过放疗诱导的自噬清除胞内受损的DNA、细胞器和蛋白质等，缓解应激压力并促进肿瘤细胞生存[8]。然而，但在不同类型的组织或肿瘤中，自噬所起作用并不相同。一方面，抑制自噬可以提高肿瘤细胞的放疗敏感性[9]；另一方面，也有研究报道诱导自噬可以降低肿瘤细胞的放疗抵抗[10]。因此调节自噬在肿瘤细胞中的表达，有望为提高放疗效果提供一个新的途径。当自噬发生时，分布于胞浆的LC3-I与磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine, PE)结合，转换形成LC3-II并定位于自噬体膜，因此LC3-II蛋白被用作检测自噬体的标志，其表达水平在某种程度上反应自噬的活性[11]。然而，仅仅检测自噬体数量不足以全面评估自噬活性，应同时结合自噬性降解底物的检测进行综合观察。p62是一种自噬特异性降解蛋白，自噬发生时，p62连同受损的细胞器在自噬溶酶体被降解，导致其表达水平降低。而当自噬发生受阻时，p62则会大量堆积[12]。因此，通过计算LC3-II/β-actin以及p62/β-actin的相对比值可以评价LC3-II和p62的表达水平，同时也一定程度反映自噬的活性。本实验显示，与对照组相比较，实验组中的LC3-II表达降低，而p62的表达水平升高，因此推测STGC3基因可以通过抑制自噬提高CNE2细胞对放疗的敏感性。

为了进一步探究STGC3基因调节自噬的可能机制，本实验通过蛋白质质谱分析照射前、后表达存在差异的蛋白，初步筛选出TUBA1B、calnexin、SFN三种差异蛋白。微管蛋白(TUBA1B)是构成细胞骨架的主要成分之一，参与多种细胞活动，如构成细胞支架，参与物质运输和转运，形成纺锤体调节细胞分裂等。研究显示，肿瘤中存在着某些微管相关蛋白的异常表达，这些蛋白可以引起微管动态系统的失衡，影响肿瘤的发生发展[13]。钙联蛋白(calnexin)是内质网中的一种跨膜蛋白，参与细胞内的代谢、应激反应、凋亡[14]，干扰钙联蛋白的表达可以提高结肠癌细胞对5-氟尿嘧啶的敏感性，降低结肠癌细胞的生存率[15]。然而，目前关于微管蛋白和钙联蛋白在自噬调控中的研究甚少，未见相关报道表明两者参与调节自噬。SFN蛋白具有调控细胞周期、信号转导、细胞增殖分化等多种功能，可以通过MAPK、PI3K、mTOR等多个途径参与自噬调节。研究表明，SFN可与hVps34、TSC2、 PRAS40等蛋白结合[16-18]，通过mTORC1途径调节自噬起始进而影响细胞自噬。除此之外，也有研究发现下调SFN可以抑制Beclin 1的表达并减少GFP-LC3的点状聚集[19]。有此可见，SFN蛋白在自噬的发生发展过程中具有重要作用。实验结果显示，与对照组相比，实验组中SFN蛋白的表达下降。因此推测，STGC3基因可能通过抑制SFN表达而抑制放疗引起的CNE2细胞自噬，但其确切的机制仍需在未来的研究中进一步探明。

综上所述，本实验结果初步表明，STGC3基因高表达可能通过抑制SFN的表达而抑制放疗引起的自噬，进而提高鼻咽癌CNE2细胞的放疗敏感性。

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