MicroRNA-4270在肝癌血浆和组织中的检测结果及分析

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(1.南华大学附属南华医院消化内科，湖南 衡阳421001；2.南华大学医学院转化医学研究室；3.南华大学附属南华医院肿瘤内科)

肝癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，发病率和死亡率均高，因此如何提高肝癌患者的早期诊治率成为近年来研究的热点和难点。MicroRNA是一种长度约为19～23个核苷酸的单链RNA，参与人体的生理病理过程[1]，在恶性肿瘤的发展中扮演着抑癌基因或致癌基因的角色，有助于癌症的诊断。目前有许多关于研究microRNA在各领域方面的报道[2-4]。例如microRNA-423可增强肝癌细胞的侵袭力，在肝癌细胞中与BRSM1的表达呈负相关，有可能作为肝癌药物治疗的潜在靶点[5]。但是目前关于肝癌与miR-4270的关系报道几乎没有，本文主要先通过基因芯片初筛选取miR-4270作为研究对象，以血浆及组织标本为生物样本，检测miR-4270表达量，并分析其与肝癌诊断的相关性，从而为miR-4270可能成为潜在的肿瘤生物学标志物提供实验依据。

1 资料与方法

1.1病例选择血浆样本选取2015年6月～2016年12月在南华大学附属第一医院及附属南华医院住院治疗的肝癌患者30例及门诊健康体检者30例。组织标本选择2014年1月～2016年12月在中南大学湘雅二医院确诊的肝癌患者癌组织40例及癌旁组织20例。选择标准：①经过彩超、腹部增强CT、AFP等临床资料，结合患者病史和症状，并经过病理组织切片结果确诊为肝癌，且原发灶为肝脏，排除其他部位恶性肿瘤所导致的转移性肝癌。②正常人血清为门诊体检患者，排除其他心、肺、脑、内分泌等方面的疾病。③癌旁组织为通过组织活检确诊为肝癌患者的远癌旁组织切片。肝癌的癌组织及癌旁组织标本于术中离体后1 h内取样，取样后组织经脱水、渗透，最后进行石蜡包埋。④实验前均取得所有试验对象的知情同意。

1.2方法

1.2.1 血浆中总RNA的提取 离心血浆样本，取上层液体200 μL，并加入1 000 μL的裂解液，严格按照miRNeasy Plasma试剂盒操作流程提取RNA。

1.2.2 血浆中cDNA的合成 将提取的血浆RNA取3 μL做模板，参照miScript II RT Kit试剂盒上操作流程，加入5×miScript HiSpec Buffer 4 μL、10×miScript Nucleics Mix 2 μL、RNase-free water 9 μL、miScript Reverse Transcriptase Mix 2 μL，组成20 μL的反应体系，逆转录得到cDNA。向完成逆转录反应体系中，加入200 μL的RNase-free water(无酶水)稀释，并暂时冷保存于-20 ℃中。

1.2.3 组织样本总RNA的提取 溶解石蜡组织，利用miRNeasy FFPE kit(50)试剂，并严格按照试剂操作流程提取RNA。

1.2.4 组织样本cDNA的合成 利用提取的组织RNA取3 μL做模板，参照miScript II RT Kit试剂盒上操作流程，加入试剂组成20 μL的反应体系，逆转录得到cDNA，最后加入100 μL的RNase-free water(无酶水)稀释，并暂时冷保存于-20 ℃中。

1.2.5 实时荧光定量PCR分析 利用逆转录得到的cDNA,使用荧光定量检测仪试剂盒，严格按照操作流程，每个样本做3个平行对照孔，行PCR检测，每个样本取平行孔的平均值进行计算。本实验采用2-Δct表示目的基因的相对表达量，同时利用内参进行数据的标准化对照。

1.3统计学分析统计学分析采用SPSS 18.0统计软件进行。其中数据分析以均数±标准差，使用独立样本t检验。可信区间为95%，P<0.05表示差异具有统计学意义。两个样本之间的相关性比较先检验是否服从正态分布，服从正态分布使用T检验，不服从正态分布的两组样本采用非参数相关系数分析(Spearman Correlation),|r|<1，r>0为正相关，r<0负相关，r=0为零相关，P<0.05表示差异具有统计学意义。应用GraphPad Prism绘制柱状图和生存曲线图。

2 结 果

2.1 miR-4270在血浆中的表达量30例肝癌患者血浆中的相对表达量为6.1±6.5，正常人血浆中miRNA-4270的相对表达量是2.7±1.7。miRNA-4270在肝癌患者血清中的表达量明显高于正常人(P<0.05)。见图1。

图1 microRNA-4270在正常人和肝癌患者的血浆表达量与正常人比较，*P<0.05

2.2 miR-4270在组织中的表达量40例肝癌患者癌组织切片中的相对表达量为11.7±18.7，癌旁组织中miRNA-4270的相对表达量是1.0±1.2。miRNA-4270在肝癌患者组织中的表达量明显高于癌旁组织(P<0.05)。见图2。

图2 miR-4270在肝癌组织及癌旁对照组织中的表达量与癌旁组织比较，*P<0.05

2.3 miR-4270表达量对原发性肝癌的诊断意义通过绘制ROC曲线(图3、图4)，可以得出，在血浆中，ROC曲线下面积为0.652，95%可信区间为0.508～0.796(P<0.05)，此时灵敏度和特异度均一般，灵敏度为63.3%，特异度为63.3%。在肝癌组织标本中，ROC曲线下面积为0.828，95%可信区间为0.723～0.932(P<0.05)，此时灵敏度及特异度均稍高，灵敏度为80%，特异度为80%。提示miR-4270的检测对肝癌的初步诊断具有重要的价值。

图3 血浆中miRNA-4270相对表达量的ROC曲线分析

图4 组织中miRNA-4270相对表达量的ROC曲线分析

2.4 miR-4270表达水平与临床相关因素的关系分析通过统计分析发现，在年龄、性别、肿块大小、肿瘤分期、AFP水平及病毒定量因素中，肝癌患者的miR-4270的相对表达量与患者临床资料之间无统计学意义(P>0.05)。见表1、表2。

2.5 miR-4270表达水平与AFP的相关性分析根据SPSS 18.0统计软件进行分析，miR-4270表达量与AFP含量不服从正态分布，故使用spearman相关分析，在血浆中，rs=0.64，P=0.736，在组织标本中，rs=0.104，P=0.530，此时P值均大于0.05，说明microRNA-4270表达量与AFP水平没有相关性，可作为诊断肝癌的独立诊断标准。

根据SPSS 18.0统计软件进行分析，将肝癌患者AFP水平分为大于400 μg/L与小于400 μg/L,把AFP<400μg/L的患者与正常人患者相对比，AFP<400 μg/L的肝癌患者表达量高于正常人(P<0.05)。见表3、表4。

表1 血浆样本中miRNA-4270表达量与肝癌临床资料相关性分析

表2 组织样本中miR-4270表达量与肝癌临床资料相关性分析

表3 血浆中AFP<400 μg/L肝癌患者与正常人miR-4270相对表达量

表4 组织中AFP<400 μg/L肝癌患者与正常人miR-4270相对表达量

2.6 miR-4270表达量与肝癌患者预后关系通过电话及门诊随访，将血浆标本和癌组织标本中肝癌患者的生存预后与miRNA-4270的表达量分别进行了统计分析。同时，将miR-4270表达量根据平均值分为低表达组(表达量小于平均值)与高表达组(表达量大于平均值)，实验发现，无论在血浆中还是在癌组织中，miRNA-4270表达量越高的患者反而生存越短，表达量低者生存期越长，P<0.05(图5、图6)。

图5 血浆标本肝癌患者miRNA生存期限图

图6 组织标本肝癌患者miRNA生存期限

3 讨 论

流行病学调查发现，肝癌的发病率和死亡率呈逐年上升趋势，是危害人类健康的重大疾病。传统的治疗包括早期的手术切除、酒精射频消融、经动脉血管栓塞术[6]，有最新报道研究，磁热疗法、索拉非尼药物化疗法也逐渐用于肝癌的治疗[7-8]。然而，肝癌起病隐匿，缺乏早期典型症状，临床症状明显者，病情大多已进入中晚期，缺乏有效的治疗方案，且晚期并发症多，严重影响患者生活质量，早期诊断发现对肿瘤患者很重要。在2017年中国《原发性肝癌诊疗规范》中，动态增强CT及MRI、超声影像、普美显动态增强MRI这四项检查成为诊断肝癌的特殊手段，其中AFP更是作为一项常规筛查的重要指标[9]。赵亚静等[10]研究发现，血清AFU(a-L岩藻糖苷酶)较AFP敏感性更高，两者联合，更能提高诊断精准率。

目前肝癌的致病作用尚未被完全阐明，但大量研究证明，与DNA的损伤、染色体的变异、抑癌基因的灭活与致癌基因的活化密不可分。MicroRNA是一类非编码单链 RNA，在人类表达有近千条，主要通过与宿主mRNA(信使RNA)结合从而发挥生物学效应。MicroRNA let-7 家族是最早发现的 microRNA 之一，作为肿瘤抑制基因，经常在人类各种恶性肿瘤中被灭活。相当多的证据表明,microRNA let-7 表达下调可能与癌症患者临床疗效不佳有关[11]。MicroRNA作为肝癌的调节因子，在肝癌的发生发展中起重要作用。研究显示，这些microRNA大致可分为两种类型[12]，一种为“肝脏特异性表达”，是指仅在肝脏组织中呈异常性表达，如 miR-122，它是肝癌中最丰富和最特定的microRNA，在肝脏中表达为上调，主要通过调节目的基因来抑制肝细胞癌；另一种为“非肝脏特异性表达”,是指在多种细胞中均可出现异常表达，如最早发现的let-7 家族，在乳腺癌、肝癌、肺癌中均有表达异常[13]。

本研究实验前期进行基因芯片初筛，考虑目前还没有关于miRNA-4270和肝癌之间关系的研究报道，选取microRNA-4270作为目标RNA。研究表明，无论是在血浆中还是组织中，肝癌患者miR-4270表达量较正常人均明显上调，差异有统计学意义。同时ROC曲线分析表明miR-4270检测对于原发性肝癌患者的敏感度和特异度均较高，可作为肝癌的辅助诊断之一。此外，本研究还发现miR-4270的表达量与患者临床资料并无显著相关性，但是，对于部分AFP<400 μg/L的肝癌患者中，miR-4270的表达量明显高于正常人，这提示在肝癌早期阶段或者对于那些 AFP<400 μg/L 的患者中，通过检测血清中 miRNA-4270的表达量，可以发现潜在的肝癌风险。而且，生存曲线分析表明miR-4270高表达者反而有更短的生存期，更加验证了miR-4270可能作为致癌基因的存在。

综合本研究证明，microRNA-4270表达水平与正常人相比明显上调，统计上存在显著性差异，而且，在对于早期AFP<400 μg/L的肝癌患者，miR-4270明显升高，提示对肝癌早期鉴别诊断、病情监测具有重要借鉴作用，为治疗方案选择提供科学依据。

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