膜联蛋白A1基因的表达与胆囊癌临床病理的关系及调控信号转导与转录因子3信号通路对胆囊癌细胞增殖凋亡的影响

江若霞 ,赵丽敏

(1.河南医学高等专科学校医学系，河南 郑州 451191；2.河南大学附属郑州市第一人民医院病理科，河南 郑州 450004)

胆囊癌是常见的消化系统恶性肿瘤，发病的机制及病因复杂，诊断困难，但大部分患者在确诊时已处于晚期，手术的切除率很低[1]。因此，寻找诊断和预防的方法进行早期治疗具有重要意义。膜联蛋白A1(annexin A1，ANXA1)是钙离子依赖磷脂蛋白结合家族中的一员，其具有参与调控炎性反应、凝血过程、钙离子通道的形成、细胞的凋亡和分化等多种生物学功能[2-4]。研究显示，ANXA1在胃癌、结肠癌、肝癌等肿瘤中表达增强，而在前列腺癌、宫颈癌等肿瘤中表达降低[5-6]，这说明ANXA1在肿瘤的发生中具有重要影响。鉴于此，本研究通过免疫组化检测ANXA1在胆囊癌中表达，研究其对胆囊癌细胞增殖凋亡的影响及机制，以期为胆囊癌的诊断和治疗提供理论依据。

1 资料与方法

1.1材料

1.1.1一般资料 收集河南大学附属郑州市第一人民医院2014年8月至2016年8月期间进行胆囊癌切除手术的患者100例，其中男性40例，女性60例，年龄范围31～85岁，平均年龄为65.82岁。术前未行放化疗，术后病理报告均为腺癌。术后按照常规的病理学检查确定组织学类型、肿瘤的分化程度。按照WHO的分级标准分为高(G1，18例)、中(G2，42例)、低(G3，36例)分化组和未分化组(G4，4例)。病理分期按照Nevin标准分为五期，其中0期4例，Ⅰ期23例，Ⅱ期34例，Ⅲ期20例，IV期19例。无淋巴转移41例，有淋巴转移59例。从100例胆囊癌组织腊块标本中随机抽取40例，取癌旁组织作为对照组，其中男性15例，女性25例，平均年龄为61.26岁。所有的样品采集均经过患者及其近亲属的知情同意及河南大学附属郑州市第一人民医院医学伦理委员会审核通过。

1.1.2细胞 人胆囊癌GBC-SD细胞株购自郑州大学。

1.1.3主要试剂和仪器 胎牛血清、胰酶、青链霉素均购自美国Gibco公司；活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase 3，Cleaved Caspase-3)、信号转导与转录因子3(Signal transducers and activators of transcription 3,STAT3)、磷酸化的信号转导与转录因子3(Phosphorylated Signal transducers and activators of transcription 3,p-STAT3)单克隆抗体及ANXA1多克隆抗体和辣根过氧化物标记的二抗均购自美国abcam公司；小干扰RNA-阴性对照(siRNA-NC)组、ANXA1-siRNA购自上海生工生物工程有限公司；DAB显色试剂盒购自TIANGEN BIOTECH北京有限公司；Annexin V-FITC凋亡试剂盒购自碧云天生物技术研究所；细胞计数(Cell Counting Kit-8，CCK8)试剂盒购自日本Dongji公司；二氧化碳细胞培养箱购自德国Heraeus公司；酶标仪购自TECAN公司；流式细胞仪购自美国Becton Dickinson公司。

1.2方法

1.2.1免疫组化及结果判定 将厚度为4 μm的蜡块切片放置于载玻片上，室温条件下去除液体，脱蜡过程使用二甲苯，脱水过程使用酒精，在3% 双氧水条件下孵育20 min后，用0.1%的胰蛋白酶消化反应15 min，PH7.4的PBS洗涤3遍，甩去PBS液，加入1∶80稀释的ANXA1多克隆抗体，孵育70 min，重新清洗3次，加入辣根过氧化物标记的山羊抗兔，DAB显色，苏木精复染，乙醇脱水，二甲苯Ⅰ、Ⅱ分别浸泡2 min、5 min，中性树胶封片。PBS作为阴性对照，相应抗体的阳性切片作为阳性对照。以Olympus数码显微成像系统进行采集、分析。随机选择10个视野，400倍观察，测定每个视野下阳性反应的平均吸光度值(IOD)，根据IOD统计阳性细胞的比例。

1.2.2细胞培养 取出保存于液氮罐中的人胆囊癌GBC-SD细胞株，置于37 ℃的水浴锅中溶解，转移溶解的细胞至一个新的离心管中，向离心管中加入含有10%胎牛血清、100 mg·L-1链霉素和1×105U·L-1青霉素的RPMI1640培养基，1 000 r·min-1离心5 min，弃上清，加入细胞培养液悬浮细胞，接种至细胞培养瓶中，置于37 ℃，5% 二氧化碳培养箱中培养。细胞长满皿底90%以上时，0.25%胰酶消化细胞，用完全培养基终止消化，按照实验需要进行传代。细胞进入对数生长期再用于实验研究。

1.2.3细胞转染 将生长至对数期的人胆囊癌GBC-SD细胞株以106个/毫升每孔加2 mL接种于6孔细胞培养板中。细胞培养24 h后，按照Lipofectamine 2000转染说明将siRNA-NC(转染对照)、ANXA1-siRNA转染到细胞内，各转染100 nmol·L-1，对照组不转染，将各组细胞与培养基充分混合后加入到人胆囊癌GBC-SD细胞，置于37 ℃，5% 二氧化碳培养箱中培养4 h，观察到细胞融合度达到80%以上时，用不含血清的RPMI1640培养基继续培养细胞24 h，更换成含血清的RPMI1640培养基继续培养。

1.2.4转染效果检测 取生长至对数期的上述三组细胞，1 000 r·min-1，离心5 min，加入适量的Trizol置于冰上裂解反应30 min后，4 ℃，14 000 r·min-1，离心15 min，吸取蛋白上清液，二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)试剂盒检测提取的蛋白浓度。将蛋白样品和上样缓冲液充分混匀，100 ℃条件下变性5 min，将蛋白加入到SDS-PAGE凝胶孔中进行电泳，电泳结束后4 ℃转膜1.5 h，5%的脱脂奶粉封闭PVDF膜2 h，以1∶500稀释的ANXA1单克隆抗体作为一抗，4 ℃孵育过夜，TBST清洗后加入1∶1 000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG，37 ℃孵育1 h，TBST清洗后加入增强型化学法(ECL)发光剂显影，自动凝胶成像系统采集图像。以GAPDH作为内参，分析蛋白表达水平。

1.2.5细胞增殖检测 将生长至对数期的上述三组细胞，以5×103个/毫升每孔100 μL细胞悬液接种于96孔细胞培养板中，置于37 ℃，5%二氧化碳浓度培养箱中培养48 h后，向每孔细胞中加入10 μL CCK8溶液，置于37 ℃，5% 二氧化碳培养箱孵育3 h，酶标仪在波长为490 nm处测定并记录OD值，计算细胞增殖率。细胞增殖率=(转染组细胞OD/对照组细胞OD)×100%

1.2.6细胞凋亡检测 取上述三组细胞，0.25%的胰蛋白酶消化细胞，调整细胞浓度为每毫升还有2×105个细胞，接种细胞至96孔细胞培养板中培养48 h后，取1 mL细胞悬液转移至离心管中，4 ℃，1 000 r·min-1，离心8 min，弃上清，洗涤细胞后加入200 μL结合缓冲液，然后加入PI和 Annexin-V各5 μL，室温避光条件下反应20 min后，再加入400 μL结合缓冲液，流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.2.7蛋白质印迹法检测STAT3、p-STAT3蛋白表达 取上述三组细胞，按照1.2.4的方法检测STAT3、p-STAT3蛋白表达。

1.3统计学方法数据采用SPSS 21.0统计软件进行分析。观测资料中的计量数据，组间比较用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验；计数资料比较采用χ2检验。以P<0.01为差异有统计学意义。

2 结果

2.1ANXA1基因在胆囊癌及癌旁组织中的表达

ANXA1在胆囊癌中阳性表达69例，阳性率为69.0%，对照组阳性表达3例，阳性率为7.5%，两组之间ANXA1阳性表达差异有统计学意义(P<0.01)。见表1。

表1 ANXA1基因在胆囊癌及癌旁组织中的表达/例

注：两组比较，aχ2=43.261,P<0.01

2.2ANXA1表达与胆囊癌临床病理参数之间的关系如表2所示，ANXA1在胆囊癌中的表达与性别、年龄不相关(P>0.05)，与肿瘤的分化程度、临床分期、淋巴转移显著相关(P<0.01)。

表2 ANXA1表达与胆囊癌临床病理参数之间的关系/例(%)

2.3转染后细胞中ANXA1的表达及对细胞增殖的影响空脂质体、siRNA-NC、ANXA1-siRNA 转染人胆囊癌GBC-SD细胞后培养48 h，siRNA-NC组细胞中ANXA1蛋白表达率为0.335±0.031，细胞存活率为(97.02±1.46)%，与对照组[0.342±0.035，(97.15±1.51)%]比较差异无统计学意义(P=0.346)；ANXA1-siRNA组细胞中ANXA1蛋白表达率为0.141±0.018，细胞存活率为(51.54±3.31)%，显著低于对照组(P=0.003～0.006 )。见图1。

2.4抑制ANXA1的表达促进细胞凋亡流式细胞仪检测空脂质体、siRNA-NC、ANXA1-siRNA 转染人胆囊癌GBC-SD细胞后培养48 h的细胞凋亡情况，结果显示，siRNA-NC组细胞凋亡率为(3.42±0.68)%，Cleaved caspase3蛋白表达率为0.162±0.017，与对照组[(3.35±0.62)%，0.154±0.015]比较差异无统计学意义(P=0.523)；ANXA1-siRNA组细胞凋亡率为(17.14±2.02)%，Cleaved caspase3蛋白表达为0.411±0.038，显著高于对照组(P=0.002～0.005)(图2)。

注：1为对照组，2为siRNA-NC组，3为ANXA1-siRNA组；与对照组比较，aP=0.002～0.005

2.5抑制ANXA1的表达对STAT3、p-STAT3蛋白表达的影响蛋白质印迹法检测上述三组细胞转染人胆囊癌GBC-SD细胞培养48 h后的STAT3、p-STAT3蛋白表达，结果显示，siRNA-NC组STAT3蛋白表达率为0.468±0.040，p-STAT3蛋白表达率为0.220±0.031，与对照组(0.462±0.039，0.216±0.026)比较差异无统计学意义(P=0.421)；ANXA1-siRNA组p-STAT3蛋白表达率为0.094±0.011，显著低于对照组(P=0.002～0.004)，三个组STAT3蛋白表达均差异无统计学意义(P=0.332)(图3)。

注：1为对照组，2为siRNA-NC组，3为ANXA1-siRNA组；与对照组比较，aP=0.002～0.004

3 讨论

膜联蛋白超家族有A、B、C、D、E五组，在人类的组织中仅存在A组，A组有13个成员，其中ANXA1是最早发现的成员。ANXA1属于胞质蛋白，在各种细胞内广泛存在，占细胞中蛋白质总含量的0.5%～2%，它既可以可溶性的形式存在，也可以稳定或可逆的形式结合在细胞骨架蛋白上[7-8]。其功能具有多样性，包括参与炎性反应、细胞凋亡和分化及信号传递等生命活动，在不同肿瘤中的表达有明显的差异，且在同一种肿瘤的不同形式中也有可能不同。在不同组织中ANXA1的不同表达均可引起肿瘤的发生，目前尚无合理的解释[9-11]。

注：1为对照组，2为siRNA-NC组，3为ANXA1-siRNA组；与对照组比较，aP=0.003～0.006

本研究中旨在探究ANXA1对胆囊癌发生发展的关系及机制。研究显示，ANXA1在食管腺癌中高表达，其表达与肿瘤的病理分期及淋巴转移密切相关，ANXA1的表达越高，肿瘤的分期越高，肿瘤的复发率越高[12]。在鼻咽癌中ANXA1低表达，其表达与淋巴转移及远处转移有关[13]。在胃癌的研究中发现ANXA1表达越低，肿瘤的恶性程度越高[14]。本研究检测ANXA1在胆囊癌中的阳性表达及与病理关系进行分析，结果显示，ANXA1在胆囊癌中的阳性表达显著高于相应的癌旁组织，且表达与肿瘤的分化程度、临床分期、淋巴转移显著相关。

RNA干扰是一种能引起内源性靶基因沉默的机制，是研究基因功能有效的方法[15]。研究显示，ANXA1在前列腺癌中高表达，沉默ANXA1的表达后能显著促进人前列腺癌细胞的凋亡[16]。胰腺癌中沉默ANXA1的表达能阻滞癌细胞于G1期并诱导细胞凋亡[17]。本研究中，检测沉默ANXA1的表达对胆囊癌细胞增殖凋亡的影响，结果显示，沉默ANXA1的表达能显著抑制人胆囊癌GBC-SD细胞增殖，并促进细胞凋亡和上调Cleaved caspase3蛋白的表达。细胞凋亡是细胞程序性死亡过程，主要有半胱氨酸蛋白酶的级联反应引起，caspase3处在caspase级联反应的下游，为细胞凋亡过程中的共同效应蛋白，被称为“凋亡的执行者”[18-19]。本研究的结果说明沉默ANXA1的表达，通过上调Cleaved caspase3蛋白的表达引起人胆囊癌细胞的凋亡。

酪氨酸激酶JAK/转录因子STAT(Janus kinase/Signal transducers and activators of transcription 3,JAK/STAT3)是近些年新发现的一个信号转导通路，由JAKS蛋白家族和STAT蛋白家族组成，该通路与肿瘤的增殖、分化等生物学特性密切相关[20]。STAT3是STAT家族中的一员，参与细胞的增殖、凋亡、分化等过程，该通路受到细胞因子、生长因子刺激后，可作用于细胞核内的特异性DNA片段，对靶基因的转录进行调控，从而使通路激活，导致细胞的增殖异常和恶性转化[21]。本研究中检测沉默ANXA1的表达对STAT3信号通路的影响，结果显示沉默ANXA1的表达后能显著抑制p-STAT3蛋白表达。

综上所述，ANXA1基因的表达参与了胆囊癌的生长、分化和迁移过程，下调 ANXA1的表达能抑制人胆囊癌GBC-SD细胞的增殖，并通过下调Cleaved caspase3蛋白促进细胞凋亡，其机制与STAT3信号通路的调控有关。该研究为胆囊癌的早期诊断和治疗提供了理论依据。

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