云南及北方主栽核桃蛋白氨基酸综合评价

耿树香，宁德鲁，贺娜，陈海云，肖良俊

(1.云南省林业科学院，云南 昆明650201;2.云南省木本油料工程技术研究中心，云南 昆明 650201)

核桃(Juglansregia)干果是坚果之王，是食用人群最多、消费量最大的干果。我国的核桃资源十分丰富，有超过上千个品种[1]。研究表明核桃仁中含量最高的两种物质是脂类和蛋白质，其中脂类的含量高达75%，蛋白质含量也达到25%[2]，核桃仁的成分中，由于产地不同，蛋白质含量约为14%-17%，其可消化率达87%，核桃蛋白生物价达98.77%。根据他人对核桃蛋白的成分分析，醇溶谷蛋白、清蛋白、球蛋白和谷蛋白这4种蛋白质组成了核桃蛋白，它们各自在核桃总蛋白中所占的比例分别为5.33%、6.81%、17.57%和70.11%[3]。从以上数据中可以看出谷蛋白是核桃蛋白中含量最高的蛋白质。刘宝尧等[4-5]以青海6个核桃分布区核桃为参照，检测其氨基酸含量,17种氨基酸被检出，其中7种人体必需氨基酸占氨基酸总量的30%左右；谷氨酸含量最高(3.531%)，其次是精氨酸(2.474%)、天冬氨酸1.723%，含量最低的是赖氨酸(0.460%)。表明不同氨基酸含量差异明显，其中精氨酸变异系数最大，缬氨酸变异系数最小。

蛋白质是核桃中重要的营养成分，核桃蛋白中含有大量的谷氨酸和精氨酸，可以开发出良好的增智、促进记忆、促进钙吸收和降血压的保健品[6-7]，还含有鲜味氨基酸(如天冬氨酸)、甜味氨基酸(如甘氨酸、苏氨酸、脯氨酸、丙氨酸)、芳香氨基酸(如酪氨酸、苯丙氨酸)及药效氨基酸(如亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸等)[8]。云南省具有种植核桃优越的自然条件，历来是中国核桃主产区之一，而目前对云南核桃及北方核桃其蛋白质的氨基酸的评价尚未深入研究。因此，本研究选择了20个具有代表性的云南核桃及13个北方核桃的核仁蛋白质及氨基酸进行对比分析与评价,筛选出氨基酸含量丰富且均衡的核桃品种，对于促进核桃资源合理利用，为云南不同品种核桃进行定性定量分析、良种选育、精深加工等提供理论依据，具有重要的指导意义[9]。

本研究选取云南主栽的20个核桃品种及陕西、山西、新疆具有代表性的13个北方核桃测定其蛋白质及氨基酸。采用模糊识别法和氨基酸比值系数法对核桃蛋白的氨基酸进行营养价值评[10]，依据营养评价指标[11]，采用系统聚类的方法将33个不同核桃品种进行分类，以期为合理开发和利用优质核桃蛋白资源提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料与试剂

供试核桃于2017年9月至10月采自云南核桃主栽区，每个品种选取生长势较一致、无病虫害的植株3株，在每株树冠的上、中和下层及里外层随机采集果实20个，充分混匀后于40℃烘干，再取样测定蛋白质及氨基酸。样品名称及编号见表1。其中1-20号为云南核桃，21-33号为北方核桃。

表1 云南核桃及北方核桃试样及编号

硫酸、凯尔特消化片(FOSS公司)、氢氧化钠、硼酸、盐酸(优级纯)、重蒸苯酚、柠檬酸钠的缓冲溶液、茚三酮溶液(二甲基亚砜150mL+pH值5.2的乙酸锂溶液50mL+水合茚三酮4g+还原茚三酮0.12g)、混合氨基酸标准溶液2.5mmoL/mL(SIGMA)。

1.2 仪器设备

BSA224S 电子天秤(北京赛多利斯仪器系统有限公司)、小型研磨机、丹麦FOSS Soxtec 2008全自动索氏抽提仪[福斯赛诺分析仪器(苏州)有限公司]、DHG-9146A型烘箱(上海习仁科学仪器有限公司)、FOSS消化炉〔福斯赛诺分析仪器(苏州)有限公司〕、FOSS全自动凯氏定氮仪(KjeltecTM8400)、Biochrom30+氨基酸分析仪(英国biochrom公司)。

1.3 试验方法

1.3.1 蛋白质含量测定

依据GB/5009.5-2010标准，准确称取0.5g粉碎好的核桃仁样品，移入干燥的定氮瓶中，加入0.1g硫酸铜、1g硫酸钾及5mL硫酸进行试样消解，制备试样溶液。加4.0mL乙酸钠-乙酸缓冲溶液及4.0mL显色剂，水浴中加热15min。于波长400nm处测量吸光度值，通过吸光度值与标准曲线比较定量求出样品中蛋白质含量[12]。

1.3.2 氨基酸组成测定

取一定量的核桃仁样品，粉碎，全部过40目筛，混匀。称取约100mg(精确至0.0001g)混匀后样品，置于20mL水解管中,加入15mL(1+1)盐酸,在水解管中充入高纯氮气，密封。将水解管放入110±1℃恒温烘箱中,水解22h,取出后冷却。将冷却后的水解液过滤，取200μL至10mL试管中,蒸干，加入1mL超纯水(除氨)复溶后,再蒸干。用1mL pH值2.2的缓冲液溶解后过0.45μm有机滤膜，上机分析。

核桃仁经酸水解后，按照GB/T 5009.124-2003《食品中氨基酸的测定》标准检测，运用氨基酸自动分析仪测定，脯氨酸在波长440nm测定，其余16种氨基酸在570nm波长下测定，17 种氨基酸在该分离条件下达到很好的分离效果。

1.4 数据分析

采用Excel 2013软件对测定数据进行整理，计算出氨基酸含量的平均值、标准差以及变异系数、核桃蛋白与模式蛋白的贴近度、RC、SRC值。并绘制出氨基酸总含量(total amino acids，TAA)和EAA含量折线图及EAA平均含量柱形图。采用SPSS 22.0软件对33个核桃品种进行聚类分析和显著性分析[13]。

2 结果与分析

2.1 云南核桃及北方核桃氨基酸组成分析

按照FAO/WHO模式或全鸡蛋蛋白模式，必需氨基酸EAA分为9类：Val、Ile、Leu、Phe、Tyr、Met、Cys、Thr、Lys[14-15]。对云南20个核桃品种的17种氨基酸含量进行统计分析，结果见表2。

表2 云南核桃氨基酸组成

续表2

编号缬氨酸Val蛋氨酸Met苯丙氨酸Phe异亮氨酸Ile亮氨酸Leu赖氨酸Lys脯氨酸Pro总含量TAAEAA10.6540.2410.5450.5390.9390.2320.83111.0253.698 20.6910.4520.6000.5701.0980.1971.27013.0464.145 30.9790.2320.9310.7231.2410.5350.31916.9835.610 40.5810.3430.4940.4830.9040.1801.01310.6933.420 50.6530.3680.5580.5471.0170.1971.08512.1163.858 60.5350.4940.4550.4390.8490.1601.12010.4763.342 70.5770.3960.4850.4710.9130.1700.72010.3483.485 80.4930.3630.4160.4040.7770.1490.9899.1132.948 90.5570.3630.4730.4610.8720.1730.97110.2643.338 102.1500.3471.6151.6072.5830.8951.14636.72711.548 110.4850.3300.4100.4050.7720.1550.7829.1032.934 120.5840.4090.4960.4850.9010.1831.05711.0403.523 131.5510.2321.1791.1652.0520.7270.81526.4938.597 142.0090.3451.5111.4932.4330.8091.06133.37110.735 151.7690.2681.2761.2871.9610.7130.47628.0169.391 161.9700.2711.4401.4502.2610.8290.88131.37110.386 171.6770.2631.2651.2262.1180.7720.60628.7729.226 181.6610.2811.2461.2222.1500.7270.68028.5739.137 191.9390.3441.4211.4172.2290.8660.58130.90010.318 201.6930.2971.3031.2732.2410.7721.03229.7849.510 SD0.0600.1700.1700.1700.2300.1300.170均值0.3101.4101.4101.3902.2300.7200.80019.4406.310CV19.35012.42012.42012.29010.30017.49021.350

由表2可知，不同品种的核桃仁均含有人体所需氨基酸的17种(色氨酸水解时被破坏，未检出),20个核桃样本的17种氨基酸均值为19.44%，其中9种必需氨基酸平均含量为6.31%，9种必需氨基酸中Tyr变异系数最大，为85%，Leu变异系数最小，为10.30%。非必需氨基酸中，His变异系数最大，为27.08%，Gly变异系数最小，为10.85%。

北方核桃氨基酸组成见表3。

表3 北方核桃氨基酸组成

续表3

编号缬氨酸Val蛋氨酸Met苯丙氨酸Phe异亮氨酸Ile亮氨酸Leu赖氨酸Lys脯氨酸ProTAAEAA212.2950.4611.7621.7422.6950.4420.89337.59512.964 222.2520.3551.6681.6652.5880.8610.94037.22712.116 232.1870.3361.6461.6242.6120.8741.00936.37111.778 242.1870.3891.6251.6182.5410.8341.01236.42511.824 251.8540.2831.3531.3732.0530.7680.54030.52010.264 261.9470.3181.4821.4542.4570.8421.02733.61410.728 272.0670.3371.5511.5372.4840.8490.94834.56211.177 281.6640.2481.2261.2361.9250.6750.83427.3508.869 291.9930.2971.4681.4362.2150.6950.58431.11510.395 301.8450.3511.3881.3702.2190.6440.72930.4229.787 311.5470.2341.1821.1692.2630.8640.67927.2538.996 322.1840.3131.6031.6192.4630.8730.77135.67211.736 332.0820.3021.5901.4362.4540.7941.01733.18510.855 SD0.2290.0590.1750.1710.2290.1270.170均值1.8810.3061.4091.3892.2280.7240.79731.06010.190CV12.19219.34612.41612.28610.29717.49021.346

注：表中TAA为17种氨基酸总量(%)；EAA为9种必需氨基酸总量(%)；SD为标准差；CV为变异系数。

由表3可知，北方13个品种核桃中17种氨基酸均值为31.06%，其中9种必需氨基酸平均含量为10.19%，9种必需氨基酸中Cys变异系数最大，为85.004%，Leu变异系数最小，为10.297%。非必需氨基酸中，Pro变异系数最大，为21.346%，Ala变异系数最小，为10.416%。表明不同核桃品种蛋白质组成差异较大。

33个核桃样TAA与EAA含量见图1。

图1 核桃中TAA与EAA含量

由图1可知，TAA含量越高EAA含量也越高，TAA与EAA波动方向一致。对TAA与EAA含量进行Pearson相关性分析，分析结果见表4。由表4可知，TAA含量与EAA含量呈现极显著正相关，其相关系数为0.998。

表4 TAA与EAA含量相关性分析

注：**表示极显著相关(P<0.01)。

2.2 氨基酸的主成分分析

对云南20个核桃品种与北方核桃13个品种的核桃仁中17种氨基酸做主成分分析和比较(见表5)。结果表明，云南核桃仁中氨基酸提取了2个主成分，第1主成分的贡献率较高，为84.848%，其中丝氨酸、天冬氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、亮氨酸、赖氨酸和丙氨酸有较大的特征向量值。第2主成分的贡献率为9.786%，其中脯氨酸和蛋氨酸有较大的特征向量值。这2个主成分的累积贡献率达到94.634%，说明这2个主成分基本概括了云南核桃仁中17种氨基酸的主要信息；另外，北方核桃仁中氨基酸提取了3个主成分，第1主成分的贡献率较高，为70.703%，其中谷氨酸、酪氨酸、异亮氨酸、丝氨酸和天冬氨酸有较大的特征向量值。第2主成分的贡献率为13.099%，其中，脯氨酸和赖氨酸有较大的向量值，组氨酸和苏氨酸有较大的负向量值。第3主成分的贡献率为10.224%，其中赖氨酸有较大的向量值。3个主成分的累积贡献率达94.026%，说明这3个主成分基本概括了北方核桃仁中氨基酸的主要信息。

表5 云南核桃仁与北方核桃仁中氨基酸主成分成分矩阵

2.3 核桃仁17种氨基酸的综合分析

用Z1、Z2代表云南核桃仁氨基酸的2个主成分，Z3、Z4、Z5代表北方核桃仁氨基酸的3个主成分，X1、X2、X3、……X15、X16、X17分别代表17个氨基酸成分，可得到如下的线性方程：

Z1=0.997X1+0.995X2+0.997X3+0.667X4+0.989X5+0.983X6+0.983X7+0.991X8+0.992X9+0.914X10+0.996X11-0.527X12+0.994X13+0.995X14+0.806X15+0.992X16-0.269X17

Z2=0.052X1+0.065X2+0.044X3-0.098X4-0.056X5+0.130X6+0.104X7+0.076X8+0.227X9+0.056X10+0.750X11+0.0371X12+0.080X13+0.109X14+0.067X15-0.045X16+0.855X17

同时，分别以第1、2、3、4主成分对应的方差贡献率a1、a2作为权数，构建的综合评价模型为,C云南=a1Z1+a2Z2

Z3=-0.971X1+0.995X2+0.972X3+0.583X4+0.807X5+0.634X6+0.943X7+0.884X8+0.993X9+0.572X10+0.966X11+0.861X12+0.978X13+0.985X14+0.909X15-0.056X16+0.577X17

Z4=-0.079X1+0.009X2-0.138X3-0.623X4+0.460X5-0.619X6+0.217X7+0.360X8-0.077X9-0.318X10-0.077X11-0.179X12-0.002X13-0.111X14+0.361X15+0.592X16+0.635X17

Z5=0.156X1+0.004X2+0.023X3+0.481X4-0.049X5+0.430X6+0.175X7-0.145X8-0.028X9-0.672X10+0.129X11-0.366X12+0.015X13+0.076X14-0.094X15+0.782X16-0.084X17

以北方核桃仁氨基酸第1、2、3主成分对应的方差贡献率a3、a4、a5作为权数，构建的综合评价模型为,C北方=a3Z3+a4Z4+a5Z5

将20个云南核桃品种与13个北方核桃品种的核桃仁中17种氨基酸指标的试验数据代入对应的表达式中，得到各品种核桃仁中氨基酸的综合得分值(C值)，见表6。

表6 各品种核桃仁中氨基酸的综合得分值(C值)

由表6可知，云南核桃17种氨基酸的综合得分值在6.288-29.368之间，蛋白品质差异较大，其综合评分20以上的有10号(昌宁细香)(29.368，最高)、14号(华宁大砂壳)(26.649)、16号(鲁甸大麻2号)(25.13)、19号(娘青)(25.015)、20号(永11)(23.7)、13号(华宁大白壳)(21.223)等11个品种。北方核桃17种氨基酸的综合得分值在7.792-25.064之间，最高为21号(陕西中林5号)，最低的为31号(新疆温185)，蛋白品质差异较小。云南主核桃品种除云新系列外，其综合评分20以上的有11个，占到全部品种的90%以上。北方核桃综合得分值在20以上的有7个，占全部北方品种的65%。云南主栽核桃品种中云新系列氨基酸的综合得分值相对偏低原因是其含油高，成熟期较早，鲜食口感纯正香甜，一般作鲜食水果核桃。

2.4 聚类分析

针对不同品种蛋白营养价值的差异进行研究，对33个品种进行了系统聚类分析[15]，采用欧氏距离测定33个不同品种之间的组内边接距离，得出最短距离聚类谱系图(图2)。从最大组内连接距离中10处进行划分，将33个品种分成3类，第1类为3号(云新36)、8号(云新高原)、11号(三台)、9号(漾濞泡核桃)、6号(云新云林)、12号(临沧漾濞泡核桃)、7号(云新306)、4号(云新43)、2号(云新303)、5号(云新301)、1号(云新64)，该类核桃蛋白品质评价最好；第2类为10号(细香)，该类核桃蛋白品质次之；其余21种核桃为第3类核桃品种，蛋白质品质较为一般。

图2 核桃品种的系统聚类分析

3 结论与讨论

3.1 结论

云南核桃与北方核桃33个品种的蛋白质氨基酸种类齐全，都含有17种氨基酸，其TAA范围为9.103%-37.595%之间，EAA含量在2.948%-11.824%之间，TAA与EAA呈显著正相关，TAA越高，EAA越高。不同品种核桃氨基酸含量差异显著。核桃仁所含氨基酸种类齐全，包含17种氨基酸，其中包括7种人体必需氨基酸。氨基酸种类、氨基酸总含量与必需氨基酸含量高低、排列次序具有一致性；而且各种氨基酸之间比例也较均衡，基本符合WHO/FAO推荐值。

云南核桃与北方核桃在在主成分分析中云南核桃仁中氨基酸提取了2个主成分，第1主成分的贡献率较高，为84.848%，第2主成分的贡献率为9.786%，这2个主成分的累积贡献率达到94.634%，说明这2个主成分基本概括了云南核桃仁中17种氨基酸的主要信息；而北方核桃仁中氨基酸提取了3个主成分，第1主成分的贡献率较高，为70.703%，第2主成分的贡献率为13.099%，第3主成分的贡献率为10.224%,3个主成分的累积贡献率达94.026%，说明这3个主成分基本概括了北方核桃仁中氨基酸的主要信息。

云南核桃与北方核桃在聚类分析中，云南云新系列及漾濞泡核桃、三台均聚于第1类，品质较好。而北方核桃聚于第2或第3类，品质居中。

在33个核桃样本的17种氨基酸的综合得分评价上，云南的云新系列虽得分值相对偏低，但在蛋白质营养价值评价上是较好，说明云南主栽品种营养及功能具有丰富多态性，每一品种均有其营养特异性，可考虑全方位开发利用。

3.2 讨论

本文研究材料取于中国核桃主栽区，结果具有一定的代表性，不同的评价方法针对不同的品质指标，在后续的研究中应结合核桃的脂肪酸组成、碳水化合物及功能活性成分指标进行深入全面的探讨。云南核桃资源丰富，可进一步扩大实验样本容量，深度挖掘并开发云南省优质核桃资源、拓宽核桃深加工领域，为云南省核桃精深加工提供一定的理论基础。

蛋白质的营养价值决定于其氨基酸组成，核桃蛋白的营养价值优于多种植物蛋白与水果，基本接近动物蛋白的营养价值，是一种具有较高开发利用价值的可食用优质蛋白质资源[6,11]。本文重点分析了EAA对核桃营养价值的影响，后续研究可以结合核桃中的脂肪酸组成及含量、碳水化合物含量等营养指标进行更深入全面的探讨。云南省核桃品种繁多，可进一步扩大实验样本量，丰富并验证营养评价和品种分类结果。研究结果为深度挖掘和开发云南省优质核桃资源、拓宽核桃产品深加工领域、指导核桃的合理种植提供一定的理论依据。

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