HPLC测定丛生竹中总黄酮及(异)牡荆苷、(异)荭草苷的含量

华梅,陈剑,毕玮,孔继君,呼延丽,李云琴,杨宇明,王娟

(1.云南省林业科学院,云南 昆明 650201;2.云南省森林植物培育与开发利用重点实验室/国家林业局云南珍稀濒特森林植物保护和繁育实验室,云南 昆明 650201;3.西南林业大学,云南 昆明 650224)

丛生竹秆形高大，单秆出材率最高，竹丛秆数多，单位面积产量远高于散生竹林，是优良特性最突出、最具推广和开发利用潜力的竹种[1-3]。丛生竹类资源生长快、生物量大，在我国林业资源中所占的地位日益重要[4]。竹子目前主要用来发展竹建筑、竹造纸、竹食品及竹工艺品产业，绝大部分竹叶未能得到充分利用，造成竹叶资源的浪费[1]。竹叶具有较好的医疗保健作用，苦竹〔Pleioblastusamarus(Keng)keng〕叶具有明目利九窍、治不睡、止消渴、解酒毒等作用，淡竹(Phyllostachysnigravar.henon)叶具有镇静、解热、止咳和止血的功效[5-6]。竹叶中具有丰富的次生代谢产物，近年研究表明，竹叶提取物具有优良的抗自由基、抗氧化、抗衰老、抗菌、杀虫、调节血脂等生物活性[7-10]。目前对竹叶化学成分的研究主要集中在散生竹[11-13]，对丛生竹研究的相对较少，李水芳等[14]以芦丁为标准品对箬竹〔Indocalamustessellatus(Munro)Keng f.〕叶中的总黄酮含量进行了紫外分光光度计测定。因丛生竹资源化学成分的研究和开发利用的需要，对更多种类的丛生竹竹叶中化学成分的分析变得迫切。本研究以勃氏甜龙竹〔Dendrocalamusbrandisii(Munro)Kurz〕、箬竹、浦竹仔(IndosasahispidaMcClure)、椅子竹(DendrocalamusbambusoidesHsueh et D.Z.Li)4种丛生竹为研究对象，采用高效液相色谱法(HPLC)，建立丛生竹竹叶中总黄酮及牡荆苷、异牡荆苷、荭草苷、异荭草苷含量测定方法。同时考察了勃氏甜龙竹超声提取的最佳方法，为丛生竹资源的开发利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

以勃氏甜龙竹、箬竹、浦竹仔及椅子竹4种丛生竹的叶子作为分析样品，样品采自于云南省林业科学院树木园(2017年3月20日)。将采集的竹叶样品清洗，自然晾干，粉碎，过40目筛备用。

1.2 试剂与仪器

主要试剂 色谱甲醇、无水乙醇、甲醇、丙酮、石油醚(所用试剂均为分析纯)、标准品为芦丁、牡荆苷、异牡荆苷、荭草苷、异荭草苷，购自于上海安谱实验科技公司。

主要仪器 高效液相色谱仪(安捷伦1260)、超声仪、旋转蒸发仪。

1.3 实验方法

(1)竹叶黄酮超声提取方法 精密称取1.00g勃氏甜龙竹样品，置于具塞三角瓶中，加入1︰10的溶剂，于40℃超声提取1h。提取液用3倍石油醚萃取3次，去除上层石油醚相，收集，用旋转蒸发仪旋蒸至干，称量重量，计算样品总黄酮得率。

(2)最适提取溶剂的确定 精密称量1.00g勃氏甜龙竹样品4份，分别加入1︰10的70%甲醇溶液、70%乙醇溶液、70%丙酮溶液及水，采用超声提取法提取，分别计算不同提取溶剂的总黄酮得率，以筛选最佳的提取溶剂。

(3)最适料液比的确定 精密称量1.00g勃氏甜龙竹样品，分别加入料液比为1︰1,1︰5,1︰10,1︰20,1︰30的70%甲醇溶液，采用超声提取法提取，分别计算不同提取溶剂的总黄酮得率，以筛选最佳的料液比。

(4)最适提取时间的确定 精密称量1.00g勃氏甜龙竹样品，分别加入1︰20的70%甲醇溶液，采用超声提取法提取，提取时间分别为20min、40min、60min、80min、120min，分别计算不同提取溶剂的总黄酮得率，以筛选最佳的提取时间。

(5)最适提取温度的确定 精密称量1.00g勃氏甜龙竹样品，分别加入1︰20的70%甲醇溶液，采用超声提取法提取，提取时间60min，提取温度分别为0℃、10℃、20℃、40℃、60℃，分别计算不同提取溶剂的总黄酮得率，以筛选最佳的提取温度。

(6)丛生竹竹叶黄酮的提取 按照超声提取的方法，对勃氏甜龙竹、箬竹、浦竹仔、椅子竹4种丛生竹中竹叶总黄酮进行提取，过滤后，滤液经3倍石油醚进行萃取，除去石油醚相，剩余提取液经0.45μm的滤膜过滤，用于HPLC分析。

(7)芦丁及竹叶黄酮标准溶液的配制 准确称取0.004 5g芦丁标准品，用色谱纯甲醇定容至10mL，配制成0.45mg/mL的芦丁标准溶液。分别取0.1mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL及1.0mL母液，分别定容至1.0mL，配制成浓度分别为0.045mg/mL、0.09mg/mL，0.18mg/mL、0.27mg/mL、0.36mg/mL、0.45mg/mL的标准溶液，经HPLC分析后，相应结果用于标准曲线的绘制。准确称取牡荆苷0.007 2g，异牡荆苷0.006 4g，荭草苷0.009 3g，异荭草苷0.005 8g，用色谱纯甲醇定容至10mL，配制成标准溶液。分别取不同体积的母液混合，定容至1.0mL，配制成不同浓度的混合标准溶液，经HPLC分析后，相应结果用于标准曲线的绘制。

(8)HPLC条件 高效液相色谱仪为安捷伦1260，色谱柱为Eclipse plus C18 column(4.6mm×150mm,5μm),流动相0.5%磷酸(A)和甲醇(B)为洗脱剂。洗脱条件为0-30min,90%A，10%B。检测波长为330nm；流速为1.0mL/min；柱温为35℃；进样量为10μL。紫外吸收扫描波长范围为200-400nm。

(9)丛生竹竹叶黄酮含量的测定 将配好的不同浓度的芦丁标准溶液按照HPLC的方法进行上样分析，所得结果用于绘制芦丁标准品的标准曲线。将提取处理好的4种丛生竹提取液按照HPLC的方法上样分析，分析结果采用外标法结合标准曲线，计算丛生竹中竹叶总黄酮含量。

(10)丛生竹中牡荆苷、异牡荆苷、荭草苷、异荭草苷含量的测定 将配好的不同浓度的竹叶黄酮标准品溶液按照HPLC的方法上样分析，进行分别上样和混合上样，所得结果用于绘制标准品的标准曲线。将提取处理好的4种丛生竹提取物按照HPLC的方法上样分析，分析结果结合混合标品中各竹叶黄酮标准曲线，采用外标法对丛生竹中牡荆苷、异牡荆苷、荭草苷、异荭草苷含量进行计算。

2 结果与分析

2.1 丛生竹竹叶黄酮超声提取工艺

研究考察了勃氏甜龙竹的超声提取工艺，以竹叶总黄酮得率为指标，分别考察了提取溶剂、料液比、提取温度及超声提取时间对得率的影响，确定其最佳的超声提取工艺为:以70%甲醇作为提取溶剂，料液比1︰10，提取温度40℃，超声提取1h(图1)。

图1勃氏甜龙竹提取工艺

Fig.1 Extraction process ofD.brandisii(Munro)Kurz

2.2 HPLC测定竹叶黄酮中总黄酮的含量

2.2.1 丛生竹样品HPLC色谱图

采用丛生竹样品的提取方法，将勃氏甜龙竹(a)、箬竹(b)、浦竹仔(c)、椅子竹(d)4种丛生竹中竹叶黄酮进行提取，处理后进行HPLC分析。4种丛生竹叶黄酮提取物的HPLC色谱图见图2。

图24种丛生竹样品HPLC色谱图

注：勃氏甜龙竹〔Dendrocalamusbrandisii(Munro)Kurz〕，箬竹〔Indocalamustessellatus(Munro)Keng f.〕，浦竹仔(IndosasahispidaMcClure)，椅子竹(DendrocalamusbambusoidesHsueh et D.Z.Li)

Fig.2 HPLC chromatogram of four cluster bamboo

2.2.2 4种丛生竹竹叶总黄酮含量

以峰面积A为纵坐标对芦丁标准品进样浓度C(mg/mL)进行线性回归，回归方程为，A=12 589.67 C(mg/mL)+80.37，R2=0.998 7。根据芦丁标准曲线及各样品HPLC总峰面积(A≥50)，采用外标法，对4种丛生竹样品中的总黄酮含量进行测定，结果见表1。4种丛生竹竹叶总黄酮含量，从高到低依次为箬竹>椅子竹>勃氏甜龙竹>浦竹仔。

2.3 HPLC测定丛生竹中牡荆苷、异牡荆苷、荭草苷、异荭草苷的含量

2.3.1 4种标准品混合的HPLC色谱图

图3为4种竹叶黄酮标准品同时进样分析的HPLC色谱图。从图3可以看出，4种标准品的色谱峰均能被同时检测到，并且各色谱峰之间实现了基线分离。荭草苷、异荭草苷、牡荆苷、异牡荆苷标准品的保留时间(RT)分别为13.978min、14.286min、15.007min、15.887min。此方法的建立，为后续丛生竹样品中4种黄酮的同时测定奠定基础。

表1 竹叶总黄酮含量

图3 混合标准品HPLC色谱图

2.3.2 4种丛生竹中牡荆苷、异牡荆苷、荭草苷、

异荭草苷含量测定

以峰面积A为纵坐标分别对牡荆苷、异牡荆苷、荭草苷及异荭草苷标准品进样浓度C(mg/mL)进行线性回归，回归方程分别为：牡荆苷A1=32 880.40 C(mg/mL)-257.80，R2=0.998 1；异牡荆苷A2=29 567.56 C(mg/mL)+405.8，R2=0.998 9；荭草苷A3=22 193.4 C(mg/mL)+183.59，R2=0.996 2；异荭草苷A4=23 969.14 C(mg/mL)+658.19，R2=0.994 4。根据4种竹叶黄酮标准品的标准曲线及各样品HPLC总峰面积(A≥50)，采用外标法，对4种竹叶样品中牡荆苷、异牡荆苷、荭草苷、异荭草苷含量进行测定，结果见表2。

表2 4种丛生竹中牡荆苷、异牡荆苷、荭草苷、

3 结论与讨论

本研究采用超声提取法对勃氏甜龙竹中竹叶黄酮进行提取，并考察了提取溶剂、料液比、提取时间及提取温度对竹叶黄酮总得率的影响，筛选出勃氏甜龙竹最佳的提取工艺为70%甲醇作为提取溶剂、料液比为1:10、超声时间60min、温度40℃。在最佳条件下勃氏甜龙竹中总黄酮得率能达到4.63%。超声提取方法所需时间较短，操作较为简单，能实现扩大化生产。

采用HPLC法及外标法，对勃氏甜龙竹、箬竹、浦竹仔、椅子竹4种丛生竹中竹叶总黄酮及牡荆苷、异牡荆苷、荭草苷、异荭草苷的含量进行测定。芦丁标准曲线方程为A=12 589.67 C(mg/mL)+80.37，R2=0.998 7，4种丛生竹中总黄酮含量分别为0.795 2%、1.166 9%、0.092 6%、0.897 2%。其中箬竹中总黄酮含量最高，浦竹仔中总黄酮含量较低。HPLC法测定箬竹总黄酮的结果与采用紫外分光光度法进行测定的相差不大(箬叶总黄酮含量在1.38%-1.92%)[15]，但采用HPLC操作更为简单，效率高，并且叶绿素对结果干扰小，结果更准确。4种标准品的标准曲线分别为，牡荆苷A1=32 880.40 C(mg/mL)-257.80，R2=0.998 1；异牡荆苷A2=29 567.56 C(mg/mL)+405.8，R2=0.998 9；荭草苷A3=22 193.4 C(mg/mL)+183.59，R2=0.996 2；异荭草苷A4=23 969.14 C(mg/mL)+658.19，R2=0.994 4。勃氏甜龙竹、箬竹和椅子竹中均含有牡荆苷、异牡荆苷、荭草苷及异荭草苷，浦竹仔中仅含有牡荆苷和异牡荆苷。本研究采用HPLC并分别以芦丁及牡荆苷、异牡荆苷、荭草苷、异荭草苷对4种丛生竹中总黄酮及黄酮单体的含量进行了测定，使得测定结果更加准确。

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