84k杨叶片离体快繁体系的优化

苟路正,曲春浦，刘关君，杨成君

(东北林业大学林学院，黑龙江 哈尔滨 150040)

84k杨是韩国成功培育的银白杨和腺毛杨(Populusalba×P.glandulosa)杂种无性系[1]。其具有易生根、材质好、抗病虫性强、适应性广等特点，对加速“三北”防护林建设、平原和城市绿化、绿色屏障的铸造、西部大开发和生态环境的改善等将发挥重大作用[2]。同时84k杨由于生长快、易出芽、繁殖迅速等特点逐渐成为杨树基因工程的重要受体树种[3]。目前关于84k杨组培技术的研究已有报道[4-6]。但现有的利用叶片作为外植体的组培体系中往往忽略壮苗培育这一过程，这会导致叶片不定芽参差不齐，生根培养后植株均一性差，生长速度慢，培养周期长等问题。本研究以成熟84k杨叶片为外植体进行不定芽的诱导，经壮苗培养使不定芽迅速生长，达到苗齐苗壮的目的，再经生根培养获得再生植株，成功地解决不定芽参差不齐、利用率低、植株均一性差等问题，为84k杨的开发利用提供了技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选取生长健康的当年生84k杨成熟叶片为外植体，试验材料来源于东北林业大学林木遗传育种国家重点实验室人工栽培的84k杨植株。

1.2 试验方法

剪取84k杨健康的幼嫩叶片，用洗衣粉液浸泡30min，自来水冲洗1h。在超净工作台上，用75%的酒精浸泡消毒20s，无菌水冲洗2次，再用0.5%次氯酸钠液浸泡消毒8min，无菌水清洗5次，获得无菌外植体材料。

培养基 以MS为基本培养基，根据试验目的添加不同浓度的6-BA(6-苄基腺嘌呤)、NAA(萘乙酸)和IBA(吲哚丁酸)，添加蔗糖20g/L，琼脂5.5g/L。调培养基pH均为5.8，121℃高压蒸汽灭菌25min，分装。

培养条件 培养温度25±2℃，光照强度2000-3 000Lx，光照时间16h/d。

叶片不定芽诱导 将消毒的叶片切成1cm2左右大小，叶面朝上，分别接种于含不同浓度6-BA(0.4mg/L、0.8mg/L、1.2mg/L)+NAA(0.05mg/L、0.10mg/L、0.15mg/L)的培养基上(表1)，每个培养皿接种6片小叶段，每组处理重复3次(3个培养皿)。光照培养，定期观察记录不定芽诱导情况。

壮苗培养 将生长至1cm左右的不定芽块分别接种于含不同浓度6-BA(0.05mg/L、0.10 mg/L)+IBA(0.2mg/L、0.6mg/L、1.0mg/L)的壮苗培养基上(表2)，每个培养瓶接种大小相同的3簇不定芽。

生根培养 将无根苗距顶部3cm处截断，分别接种于含不同浓度IBA(0.6mg/L、0.8mg/L、1.0mg/L)和NAA(0.2mg/L、0.4mg/L)的生根培养基中，每瓶接种1棵无根幼苗，每组重复20次(表3)。

生根苗移栽 生根培养30d左右，选择根系发育良好，株高8-10cm，根系长度≧6cm的84k杨无菌苗，把根部沾附的培养基轻轻捏碎，在水中清洗干净，在此过程中避免伤及根部或造成根部断裂、脱落。移栽基质以纯的草炭土为宜，移栽前自然吸水至土壤湿润，苗木栽好后及时扣上培养瓶(工厂育苗时可以覆膜)，培养3d后将组培瓶倾斜，开一小口，使苗逐步适应外部环境，培养7d后将瓶子摘掉，每天喷水3-5次保湿。

1.3 统计及分析

在不定芽诱导期间，记录观察苗木的生长状况，20d后计算不定芽诱导率、平均芽数、玻璃化程度(见表1)。不定芽诱导率=出芽的叶片数/接种总叶片数×100%，玻璃化程度=玻璃化的不定芽/诱导出的不定芽总数×100%；在不定芽壮苗培养期间，观察不定芽的生长速度、高度(分别在培养的第10d、20d记录)以及生长状态(见表2)；在生根培养期间，观察记录植株生长情况，21d后计算生根率和平均根数(见表3)，生根率=生根苗总数/接种的芽苗总数×100%，平均根数=根的总条数/处理苗数。以上数据均采用Microsoft Excel软件进行处理分析。

2 结果与分析

2.1 叶片不定芽诱导

将消毒后的外植体接种到叶片分化培养基上(图1-A)，培养7d左右，外植体切口处逐渐膨大卷曲呈瘤状，2周左右颜色由浅变深，逐渐变成深绿色并出现绿色不定芽点(图1-B)，3-4周，不定芽生长旺盛逐渐形成簇状不定芽(图1-C)。

A.叶片外植体接种B.培养14d的不定芽C.培养21d的不定芽

图1叶片不定芽的诱导

Fig.1 Induction of adventitious buds in leaves

表1为培养20d的统计结果。可以看出不同植物生长调节剂对84k杨叶片不定芽的诱导影响较大。在细胞分裂素6-BA浓度一定的情况下，随着NAA浓度的升高，不定芽的诱导率和不定芽数相应增高；在NAA浓度固定的情况下，随着6-BA浓度的增高，不定芽的诱导率和不定芽数也相应提高。综合结果，培养基MS+6-BA 0.8mg/L+NAA 0.1mg/L不定芽的诱导率达100%，平均不定芽数为15.06，不定芽生长速度快，生长健壮，无玻璃化，为本试验叶片不定芽诱导最佳培养基。

表1 生长调节剂对叶片不定芽诱导的影响

2.2 壮苗培养

将诱导出的不定芽接种到壮苗培养基上，培养7d左右不定芽开始增高，10d左右芽高可达2-4cm(图2-A)，20d左右芽高可达6-8cm(图2-B)。表2为培养20d的统计结果。MS+IBA 0.6mg/L+6-BA 0.1mg/L对不定芽的壮苗效果最好，抽茎速度快，不定芽生长健壮，茎粗壮，叶鲜绿色，无黄化现象。添加IBA 0.2mg/L+6-BA 0.05mg/L的培养基不定芽高度无变化，叶片黄化严重；添加IBA 0.2mg/L+6-BA 0.1mg/L、IBA 1.0mg/L+6-BA 0.05mg/L和IBA 1.0mg/L+6-BA 0.1mg/L的培养基不定芽生长速度较慢，高度达到6cm后不再增加；添加IBA 0.6mg/L+6-BA 0.05mg/L的培养基不定芽长势均一，生长速度快，茎粗壮，但少数出现叶片黄化现象。综合结果，培养基MS+IBA 0.6mg/L+6-BA 0.1mg/L为本试验最佳壮苗培养基。

A.壮苗培养10dB.壮苗培养20d

图2 壮苗培养

2.3 84k杨生根培养

将无根苗距顶部3cm处截断，接种在生根培养基上培养，1周左右根部生长点突出，开始诱导生根(图3-A)，21d后根系生长良好(图3-B)，统计生根试验结果(表3)。培养基MS+IBA 0.6 mg/L+NAA 0.4mg/L与其他培养基相比差异显著，表现为生根速度快，侧根数量多，根系健壮，植株生长旺盛，株高可达10cm以上。添加IBA 1.0mg/L+NAA 0.2mg/L和添加IBA 0.8mg/L+NAA 0.2mg/L的培养基生根缓慢，侧根少或几乎无侧根，个别不生根，植株生长慢。MS+IBA 0.8mg/L+NAA 0.4mg/L培养基和MS+IBA 1.0mg/L+NAA 0.4mg/L生根较快，但侧根数量少，根系较短。IBA 0.6mg/L+NAA 0.2mg/L的培养基生根快，侧根数量多，但根系细长偶尔出现叶片发黄现象。综合根的数目、长度及苗的生长状况，筛选出MS+IBA 0.6mg/L+NAA 0.4mg/L为84k杨最佳生根的培养基。

2.4 生根苗移栽

多次试验证明，以纯草炭土为基质，扣瓶(或覆膜)培养的移栽方式非常适合84k杨组培苗的生长，成活率高达97%。

A.生根培养7dB.生根培养21d

图3 生根培养

3 结论与讨论

目前已知的84k杨叶片组培体系一般经过愈伤组织诱导-不定芽诱导-壮苗(有或无)-生根培养等4个过程[7-9]，本次试验经过叶片不定芽诱导-壮苗-生根3个培养过程获得再生植株。

本试验中84k杨最佳叶片不定芽诱导培养基为MS+6-BA 0.8mg/L + NAA 0.1mg/L，在此培养基中叶片易被诱导，1周左右叶片边缘开始卷曲膨大，两周左右出现绿色不定芽点，3-4周不定芽生长旺盛逐渐形成簇状丛生芽。从试验结果看，较高浓度的6-BA和NAA有利于不定芽的诱导和生长，这与张静等研究的结论[5]一致。不定芽的玻璃化程度与细胞分裂素的浓度密切相关[10-11]，高浓度的6-BA会导致不定芽玻璃化现象严重，这与孙晓红等[12]的研究结论一致。

现有的利用叶片作为外植体的组培体系中往往忽略壮苗这一过程。叶片诱导的不定芽长势不均且真正可以用来生根的不定芽数量较少，但经壮苗培养后不仅能够改善不定芽的生长状况而且可以起到第二次增殖的效果，之前较小的不定芽会迅速生长达到生根培养的要求，再经过统一截顶生根可以极大地提高生根苗均一性。本试验中84k杨最佳壮苗培养基为MS+IBA 0.6mg/L+6-BA 0.1mg/L，在此培养基中丛生芽生长速度快，生长健壮，长势均匀，茎粗壮，叶色鲜绿，而刘广卿等[13]研究的结论表明WPM+6-BA 1.0mg/L+NAA 1.5mg/L+IBN 1.00mg/L+ZT0.05mg/L的壮苗效果较好。与6-BA相比IBA对于丛生芽壮苗的影响要更大一些，这可能与生长素与细胞分裂素的作用不同有关[14-15]，壮苗过程主要是不定芽高度和粗细的增加，在这一过程中以营养生长为主，顶端优势明显，生长素起主要作用[16-17]。

84k杨在MS+IBA 0.6mg/L+NAA 0.4mg/L的培养基上生根率为100%，生根速度快，侧根数量多，根系健壮，植株生长旺盛，为本试验最佳生根培养基，而李科友等、杨琳娜[18-19]研究的结论表明1/2MS+NAA 0.02mg/L和1/2MS+NAA 0.05mg/L+IBA 0.05mg/L的生根效果较好，与本次结果的差异主要体现在较低生长素的浓度上。在移栽过程中，如果组培苗不经处理直接移栽，叶片很快失水萎蔫，成活率很低，扣瓶(或覆膜)是为了让苗木逐步适应外部环境，提高苗木成活率[20]。

综上，本研究以84k杨叶片为外植体，经不定芽诱导，壮苗和生根培养形成完整植株，移栽至土壤后得到生长整齐，表型一致的健壮苗木，为84k杨的开发利用提供技术支持。

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