梨果实褐变的研究进展

苏艳丽，田永真，杨 健，王 龙，王苏珂，薛华柏，李秀根

(中国农业科学院 郑州果树研究所，河南 郑州 450009)

梨是我国第三大水果，分布范围广、适应性强，种质资源极为丰富。可鲜食、榨汁、制干、酿酒、入药等，被称为“百果之宗”。梨果实肉质脆嫩、汁多味甜，含有多种营养成分，具有一定的医用价值和保健作用，已有研究认为，梨的保健作用与其所含酚类物质密切相关[1-3]。酚类物质对果实品质具有双重影响，一方面，它使果汁具有独特的收敛口味，如果实中多酚含量过低，就会影响其口感；另一方面，过多的酚类物质是果实产生苦涩及褐变的主要因素[4]。

果实褐变现象在园艺产品中普遍存在，褐变不仅影响果品的外观、风味、营养、商品价值，而且还阻碍产品流通，缩短货架期，已成为贮运加工的主要障碍，全世界每年因褐变造成的果蔬损失超过总损失量的50%[5-6]。由于梨的褐变活化能较其他水果偏低，导致梨鲜切果、果汁及果实在贮藏时更易发生褐变，破坏了果实、果汁的色泽及营养成分，甚至使果实、果汁变质，从而严重影响了梨果实的产后附加值及经济效益。

酚类物质作为褐变反应的底物，是引起果实褐变的重要因素。果实褐变按其发生机理可分为酶促褐变和非酶促褐变。酶促褐变是指多酚氧化酶(polyphenoloxidase,PPO)催化酚类物质反应形成醌类物质及其聚合物的过程，它的发生需要同时满足3个条件：酚类物质、PPO以及氧。非酶促褐变又可分为美拉德反应、焦糖化反应、抗坏血酸氧化分解、多元酚氧化缩合，反应底物主要是维生素C(Vc)和酚类物质。这2种褐变在梨褐变中均存在，本研究通过综述国内梨果实及果汁的褐变研究进展，为褐变机理的深入研究及加工型、功能型梨果实的培育提供参考。

1 梨果实的褐变

1.1 梨果肉的褐变

鲜切梨果实的褐变以酶促褐变为主，是以酚类物质为底物，在PPO催化下进行的生化反应。研究表明，PPO是鸭梨[7]、砀山酥梨[8]、库尔勒香梨[9]、燕安3[10]、黄冠梨[11]、南果梨[12]、翠冠[13]等酶促褐变过程中主要的酶。

梨果肉酶促褐变与酚类物质的含量和PPO活性呈正相关，褐变往往是多种酶共同作用的结果[14]。PPO是酶促褐变的主要酶，但它并不是启动果实褐变的关键酶，过氧化物酶(peroxidase,POD)作为参与酶促褐变的主要酶类，不是梨果肉酶促褐变的关键因素[15-16]，且酶促褐变与过氧化氢酶(catalase,CAT)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)关系也不显著[15]。F.C.Richardforget[17]等研究发现，梨的POD本身并不能直接氧化酚类底物，但在PPO存在的情况下，POD会加剧酚类物质的降解，促进梨果实及其制品的褐变。邹丽红[18]等和张亚伟[19]等发现砂梨果实褐变与PPO活性相关性高于POD、CAT和SOD；鸭梨汁酶促褐变主要受抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidase,APX)、CAT和POD的影响；影响黄金梨发生酶促褐变的酶主要为PPO和APX；新高梨酶促褐变受PPO、POD和SOD的影响，且影响程度依次是PPO>POD>SOD[20]。

袁江[21]等研究表明，酶促褐变与总多酚和绿原酸含量的相关度高于与酶类的相关度，果实抗氧化活性对褐变的影响最小。酚类物质和酶对褐变的影响因素依次为：总黄酮>表儿茶素>总多酚>POD>对香豆酸>儿茶素>绿原酸>可溶性蛋白>熊果苷>咖啡酸>谷胱甘肽(GSH)>CAT>苯丙氨酸解氨酶(PAL)>芥子酸，总黄酮、表儿茶素、总多酚含量是影响梨果肉酶促褐变的关键因子[18]。

1.2 梨果汁的褐变

在梨汁饮料的加工中，酶促褐变和非酶促褐变均存在。在加工的不同阶段，2种褐变的影响程度也各不相同。梨汁在加工破碎中发生的褐变多为酶促褐变，在贮藏销售过程中的褐变则以非酶促褐变为主[22]。

梨汁的酶促褐变与酶类的相关度高于与总多酚含量的相关度，且与梨果实的pH也显著相关[19,23]。梨汁的非酶促褐变与总多酚密切相关，另外，糖、氨基酸、维生素也是引起非酶促褐变的主要成分。梨汁褐变过程中，酶促褐变主要与相关酶和总多酚含量有关，主要相关酶因品种而异，相关酶类的活性、酚类物质含量和组成以及对梨汁酶促褐变的影响程度也因品种的不同而存在差别。

梨汁褐变是制约梨汁加工产业发展的一个严重障碍，通过对梨不同品种制汁性能的研究，已初步筛选出适合制汁的一些品种，如锦香、黄金、安梨[23]；秋黄、细把清、馨香、早生喜水、秋荣、金水、丰水、黄花、今村秋、木瓜、若光、兴城谢花甜、色尔克匍、南果梨、三季梨、秋香[24-25]；黄冠梨[19]；贮藏中长把梨和鸭梨浓缩汁保持较好[26]。本研究在前期工作中，筛选出翠冠、新杭等近10个果肉和果汁均不易褐变的梨种质资源，为梨制汁原料的筛选提供参考，也为开展褐变相关研究奠定理论基础。

总之，酶和酚类物质都是梨果实褐变发生的重要影响因素和必备条件，明确不同品种褐变中酶的影响程度、作用方式以及作用底物酚类物质的种类是了解其褐变机制的关键。

2 梨果实褐变的影响因素

2.1 梨果实酶促褐变的影响因素

2.1.1 褐变底物酚类物质的多样性 酚类物质是梨果实组织褐变的物质基础及反应底物，在果实生长发育中合成，不同发育时期呈动态变化。酚类物质的具体种类因品种、栽培条件、部位等不同而不同，并且在褐变过程中起主要作用的酚类物质也各不相同。一般而言，同一梨果实中，果心和果皮中的总多酚含量>果肉[27-28]。秋子梨系统果实的总多酚和总黄酮含量显著高于其他梨系统，西洋梨、新疆梨、白梨居中，砂梨最低[29-30]。梨果实中主要酚类物质有绿原酸、熊果苷、儿茶素、槲皮素、表儿茶素、芦丁、没食子酸等，绿原酸的平均含量为57.60 mg·kg-1，熊果苷的平均含量为47.09 mg·kg-1，儿茶素的平均含量为6.88 mg·kg-1，槲皮素的平均含量为3.88 mg·kg-1， 表儿茶素的平均含量为1.76 mg·kg-1，芦丁的平均含量为1.00 mg·kg-1，没食子酸的平均含量为0.55 mg·kg-1[18]，其中，绿原酸和熊果苷的含量占总酚含量的85%以上，是梨果实中主要的酚类物质。

2.1.2 酶促褐变中多酚氧化酶(PPO)的活性 梨果实细胞内能够氧化酚类底物的酶主要是PPO，它是植物体内普遍存在的一种含铜离子的膜结合蛋白酶，在有氧条件下催化酚类物质转变成红褐色，再与氨基酸氧化缩合生成黑褐色聚合物，是梨果实酶促褐变过程中主要的酶。影响PPO活性的因素有：浓度、温度、pH值、果实成熟度等。

植物中PPO的最适pH一般在5.0～7.0，随着pH的下降，PPO的活性直线下降，特别是pH在3.0以下时，高酸性环境会使酶蛋白上的铜离子解离下来，导致PPO逐渐失活，酶活性趋于最低[31]。不同梨品种中的PPO活性不同(表1)。

表1 不同品种梨果中PPO的最适pH和温度Table 1 Optimal pH and temperature of PPO in different pear varieties

不同梨品种，酶促褐变中PPO的最适酚类底物不同[19,38]，已有的研究认为，梨果实中主要的褐变底物为绿原酸，其次为表儿茶素和儿茶素[12,21,39]。苹果梨中PPO对4种酚类底物的催化能力依次为：没食子酸>儿茶酚>绿原酸>咖啡酸[30]。

PPO活性的最适pH值取决于酚类底物。对于邻苯二酚和4-甲基儿茶酚，在pH值为5.0时，PPO活性最高；绿原酸的PPO最佳pH为6.0；当底物是多巴胺、咖啡酸和儿茶素时，PPO的最适pH为7.0；而邻苯三酚的最适pH则为8.0[40]。因此，针对不同梨品种，需要有针对性地找出影响PPO活性的主要酚类底物以及不同酚类底物的最适pH。

2.2 梨果实非酶促褐变的影响因素

2.2.1 温度 非酶褐变受温度的影响较大，温度相差10℃，褐变速度可相差3～5倍，如美拉德反应一般在30℃以上发生较快，而在10℃以下存放则能抑制褐变的发生[41]。通常情况下，果汁贮存温度越高，贮存时间越长，则非酶褐变反应越严重，且褐变速度也加快。另外，温度的稳定性对褐变也有一定影响，在恒温条件下贮藏褐变速度及酚类物质的损失也远远<变温储存[42]。

2.2.2 pH 一般而言，酸碱值越高，非酶促褐变反应越严重[38]。果汁的pH值在3.0左右时非酶褐变较轻，pH值太高或太低都会导致非酶促褐变的发生[43]。

2.2.3 金属离子 金属离子对非酶褐变起催化作用，如Fe3+、Fe2+、Cu2+、Li2+等离子对果汁褐变有促进作用，而Sn2+、Ca2+、K+等离子有抑制褐变反应的效果[44-46]。

2.2.4 氨基酸含量 氨基酸是参加美拉德反应和焦糖化反应的主要反应物之一，因此氨基酸含量是影响果汁非酶褐变的重要因素。贮藏中，氨基态氮和多酚的交互作用是决定梨浓缩汁褐变的主要因素[26]。杨毅[47]等认为浓缩梨汁的14种氨基酸在37℃和50℃贮存中，浓度下降最多的是天冬氨酸，而蛋氨酸、亮氨酸和苏氨酸的浓度没有明显变化，最具反应性的氨基酸是赖氨酸。

2.2.5 5-羟甲基糖醛(5-HMF)含量 一般认为5-HMF是葡萄糖或果糖在酸性条件下脱水分解产物，是美拉德反应、焦糖化反应及抗坏血酸氧化分解反应共同的中间产物。

2.2.6 糖 在果汁加工及贮运过程中，糖除部分与氨基化合物进行美拉德反应外，还会发生焦糖化反应，从而影响果汁的品质，王成荣[48]等对梨汁的非酶褐变研究中发现，糖是影响非酶促褐变的重要因素，糖度增加，非酶促褐变速度加快。

2.2.7 成熟期 适时采收可减轻果实贮藏期褐变的发生，采收早晚与果心褐变和果实腐烂密切相关。有研究表明，采收越晚，果心褐变指数越高[49-52]。

糖、氨基酸、维生素和酚类物质是果汁非酶促褐变反应的主要成分。C.J.Cornwell[53]等认为美拉德反应和抗坏血酸氧化是非酶促褐变的主要原因，而杨毅[47]等认为浓缩砀山酥梨汁的非酶褐变主要由美拉德反应引起，其他反应没有显著贡献。

3 梨果实褐变的抑制方法

3.1 酶促褐变中PPO活性的抑制方法

多酚氧化酶(PPO)是酶促褐变的关键酶，对褐变的抑制主要是抑制PPO的活性。PPO特性及其抑制效应研究一直是果蔬酶促褐变生理生化研究的重要内容。抑制PPO酶活性的方法有很多种，常见的有物理方法、化学方法和生物方法。

3.1.1 物理方法 常用的有：热处理、低温漂烫、低温贮藏、减少或去除多酚[如没食子酸丙酯(PG)[54]和聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)][55]、高压处理、去氧或隔离氧、辅照处理[56-57]、降低pH值[21]。杨光宇[35]认为在加工过程中控制pH值和温度可以有效地防止褐变的发生，高温可抑制PPO活性。

3.1.2 化学方法 目前采用的化学方法主要是添加褐变抑制剂，褐变抑制剂分为还原剂、酶抑制剂、酸化剂(常用的有柠檬酸、苹果酸、抗坏血酸及其它有机酸混合溶液)、鏊合剂、络合剂等。已有的研究报道柠檬酸、半胱氨酸、抗坏血酸、氯化钙、β-环糊精(β-CD)、乙二胺四乙酸(EDTA)、偏亚硫酸氢钠、茉莉酸甲酯、4-己基间苯二酚(4-HR)等均对PPO活性有较强的抑制作用[58-62]，且L-半胱氨酸抑制效应较好[34]。常大伟[63]等和李磊[64]等研究认为，抑制剂对酶促褐变的抑制强弱顺序为：抗坏血酸>氯化钙>柠檬酸>β-CD>EDTA，并且抗坏血酸、β-CD、EDTA 3种抑制剂之间为协同作用，最佳组合为抗坏血酸浓度0.10%、β-CD浓度0.4%、EDTA浓度0.08%。

不同抑制剂对不同氧化酶的抑制效应不同，Vc对POD具有最强的抑制作用，柠檬酸对APX的抑制作用最强，L-半胱氨酸对PPO的抑制效应最强[19]。另外，刘超[65]等通过利用辐射和pH处理梨汁，发现3kGy辐照与pH 3.1复合处理能抑制多酚氧化酶约92%的活性。

3.1.3 生物方法 目前研究出对梨PPO活性有抑制作用的生物制剂有：天然提取物乙醛、食用大黄汁、蜂胶、可食性被膜[66-70]、洋葱提取液[71]、桑树枝条提取物[72]和扁实柠檬汁[73]等。另外，杨光宇[35]研究表明杜仲叶、银杏叶、葡萄叶3种天然植物提取物均对果蔬PPO有一定的抑制作用，抑制率均随着浓度的增加而增大，并得到3种天然提取物与Vc结合形成的复合抑制剂，最优配方为Vc 0.006%、银杏叶提取物1.5 mL、杜仲叶提取物0.5 mL、葡萄叶提取物1.5 mL，对PPO活性抑制率可达95%。乔勇进[74]等研究认为萝卜提取液对梨PPO活性有抑制作用，且以加热萝卜提取液抑制效果最佳，随着加热温度和加热时间的延长，萝卜提取液对PPO活性的抑制作用更明显。

3.2 非酶促褐变的抑制方法

3.2.1 控制加工及贮藏条件 在果汁浓缩过程中，真空浓缩及50℃减压浓缩，对果汁进行高温处理和脱气处理，控制发酵温度，适当降低梨浓缩汁的pH，5℃以下低温恒温贮藏均有利于抑制非酶促褐变[26,41]。果汁的pH值在3.0左右时非酶促褐变较轻，pH值太高或太低都会促使非酶促褐变的发生[43]。

3.2.2 控制反应底物 尽量避免与金属器具接触、去除氨基酸等。

3.2.3 添加褐变抑制剂 添加亚硫酸盐、含硫氨基酸、有机酸、EDTA、氯化钙等抑制剂。赵光远[22]等研究认为曲酸、半胱氨酸、抗坏血酸、氯化钙和氯化钠均是混浊梨汁较好的防褐变剂，混合使用比单一使用效果要好。徐芹[34]等研究表明，1 mmol·L-1的L-半胱氨酸可抑制梨汁褐变，而高浓度5 mmol·L-1的半胱氨酸促进梨汁褐变。柠檬酸作为褐变抑制剂通常与抗坏血酸或亚硫酸混合使用，达到更好的效果[43]。

前人针对梨果实褐变的抑制进行了较系统的研究，主要是PPO酶活性和非酶促褐变的抑制，从物理、化学、生物等方面找到一些抑制褐变的有效措施，抑制方法在不断改进，多种抑制剂及抑制措施综合利用效果更好。

4 梨果实褐变的分子机理

目前，有关果实的褐变大多集中于生理机理的研究，有关分子机理的研究较少。与褐变相关的分子机理的研究，已开展的有PPO、PAL等酶基因的克隆及表达分析，从分子水平进一步验证这些相关酶类及酚类物质与褐变的关系，如姜翠翠[75]克隆得到木奈果肉的PPO基因全长序列；C.Coetzer[76]等将PPO基因片段反向插入马铃薯，结果茎块中酚类物质氧化受阻，表皮褐变受到控制；李正国[77]等研究认为，PAL活性变化以及PAL2基因的表达与果皮褐变具有非常密切的关系；M.D.Guardo[78]等将苹果果肉褐变定位在基因组上，在这些基因中PPO和PAL与褐变关系最密切，且数量性状定位(quantitative trait locus,QTL)内这个PPO的2个单倍型特征与苹果褐变相关联；S.A.Khan[79]等和D.Chagne[80]等都发现，羟基肉桂酸/奎尼酸转移酶(HCT/HQT)和第17连锁群底部的一个绿原酸QTLs共分离，猜测绿原酸QTL的候选基因是Md-HCT；赵继荣[81]对苹果的研究也认为Md-HCT是果实绿原酸合成的关键候选基因。樊晶[82]等通过RACE技术成功克隆了与脐橙果皮褐变相关基因CsNAC；潘德灼[83]等从蛋白质组学方面探讨龙眼果实采后果皮褐变过程的差异表达蛋白变化情况，推测是酚类物质反应生成褐色物质，从而导致果皮发生褐变。

与褐变关系密切的多酚物质，其代谢过程中，原花青素(proanthocyanidins)的合成有无花色素还原酶(LAR)和花色素还原酶(ANR)2个重要的限速酶，R.Espley[84]等推测苹果LAR1基因的转录因子是MYB10；J.Bogs[85]等认为葡萄MYB转录因子VvMYBPAL调控VvLAR1的表达，另外发现转录因子VvMYBPA2和YvMYB5b也能促进原花青素的合成。

目前，国内有关梨果实褐变分子机理的研究更少，和其他水果一样，研究集中于褐变相关的氧化酶(如脂肪氧合酶(lipoxygenase,LOX) 等)和多酚代谢相关的酶等酶基因的克隆及表达分析，从分子水平进一步验证了这些相关酶基因与褐变的关系。如闫洪波[86]等克隆获得了鸭梨PbPAL1和PbPAL2基因，认为它们参与了损伤引起的组织褐变过程；J.G.He[87]等研究表明，在雪花梨果实的不同发育时期，绿原酸合成的相关基因PbPAL1、PbPAL2、PbC3H、PbC4H、Pb4CL1、Pb4CL2、Pb4CL6、PbHCT1和PbHCT3的表达水平随绿原酸含量的逐渐减少有所减弱，认为这些基因是控制绿原酸合成的关键基因；程秀云[88]克隆得到木质素生物合成关键酶基因PbCOMT1、PbCOMT2以及转录因子PbMYBR、PbMYB31的全长序列，其中PbCOMT1比对后与GenBank中已知的砀山酥梨COMT(登录号：KC905086.1)相同，认为基因PbCOMT1和PbCOMT2以及转录因子PbMYBR、PbMYB31与褐皮的形成有关，可能是褐皮形成的重要因子；李晓丹[89]等研究认为，LOX基因与鸭梨果肉的褐变有密切的联系。总之，现代分子技术水平的迅速发展为果蔬褐变机制的探索、品种改良以及抗褐变种质的选育提供了新的思路。

5 结论

梨果实[90]的褐变以酶促褐变为主，梨果汁的褐变是在发生酶促褐变的同时伴随非酶促褐变，梨汁加工过程中以酶促褐变为主，贮藏销售过程中以非酶促褐变为主。引起褐变[91]的因素非常复杂，采后衰老以及不良的环境条件等都会导致果蔬组织褐变的发生。目前针对梨褐变的研究主要集中在褐变的生理机理和褐变的抑制方法两大方面，初步开展了分子机理的研究，未来可以从以下几个方面进行研究：

引起梨果实褐变的原因是复杂的、多方面的，酶促褐变主要是多酚、酶在一定pH条件下互相作用的结果。多酚物质、酶的活性随果实发育过程呈动态变化，但缺乏动态的相关研究，今后可依据梨果实的发育过程， 纵向研究果实不同发育时期多酚物质、相关酶及环境酸度与梨果实褐变的作用原理，更直观地找出影响梨果实褐变关系密切的物质，进一步明确梨果实褐变的生理机理。

不易褐变梨种质资源的筛选。我国有丰富的梨种质资源，但缺乏系统的果实、果汁褐变情况的数据采集，因此，对我国现有资源进行评价，筛选不易褐变的资源，为后期的品种选育和分子机理的研究奠定基础。

相关标记的开发应用。构建梨果实褐变研究群体，进行褐变关系密切物质的QTL定位，用于不易褐变杂交后代单株的早期选择，选育不易褐变的品种，从根本上解决梨果生产、加工中易褐变的问题。

加强梨果实褐变分子机理的研究，找出影响果实褐变的关键基因及调控因子，尝试从基因调控方面来克服梨果实的褐变问题。

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