杉木木糖合成酶基因ClUAXS2的全长克隆与分析

张 颖，苏烁烁，陈婉婷，陈冉红，李 明,2*，马祥庆,2

(1.福建农林大学 林学院，福建 福州 350002；2.国家林业局 杉木工程技术研究中心，福建 福州 350002)

UDP-木糖(UDP-Xyl)是植物体内由D-葡萄糖醛酸脱羧而成的一种尿苷二磷酸五碳糖，主要作为糖基供体合成植物半纤维素木聚糖[1]、木葡聚糖[2]等多糖物质，与植物细胞壁生长和木材的形成密切相关。UDP-木糖也可通过核苷糖之间的合成和转化途径参与形成一些植物天然小分子化合物的次生代谢过程，是合成糖蛋白或糖脂的主要成分[4-6]。UDP-芹菜糖(UDP-Api)是合成高等植物细胞壁中的果胶多糖物质鼠李糖半乳聚糖Ⅱ(RG-Ⅱ)的一种支链五碳糖，通过在植物生长发育中交联细胞壁多糖和硼酸而起作用[7-8]，一般在植物体内含量较少，对于富含芹菜苷的浮萍(Spirodelapolyrhiza)和欧芹(Petroselinumcrispum)，合成UDP-Api的研究早已存在[9-11]。UDP-木糖和UDP-芹菜糖是构成植物细胞壁初生壁和次生壁多糖的主要组分，同时还参与了植物果胶聚糖的组成及相关糖蛋白中糖链的构成。因此，用于合成UDP-木糖和UDP-芹菜糖的糖苷合成转化酶的结构和功能备受关注。植物体内可用于同时合成UDP-木糖和UDP-芹菜糖的作用酶为UDP-木糖合成酶(UDP-D-Apiose/ UDP-D-Xylose synthase，UAXS)，其能够催化UDP-葡萄糖醛酸形成UDP-木糖和UDP-芹菜糖2种糖基供体。

植物体内第1个被发现和鉴定的UDP-木糖合成酶(UDP-D-Xylose synthase，UXS)为拟南芥(Arabidopsisthaliana)的AtUXS1[12],随后于2003年在拟南芥中发现既能合成UDP-木糖，也能合成UDP-芹菜糖的双功能酶AtAXS1[13]。其中，UXS在NAD+作为辅酶参与下通过不可逆的脱羧反应将UDP-葡萄醛酸(UDP-D-GlcA)转化成为UDP-Xyl[13]。采用病毒诱导基因沉默的方法对烟草(Nicotianabenthamiana)NbAXS1基因研究表明，NbAXS1蛋白酶定位于细胞质中，当NbAXS1基因沉默之后，植株生长停滞，同时由于细胞壁中RG-Ⅱ缺乏致使烟草细胞壁结构异常[14]。UAXS还能够调节植物体内UDP- Xyl和UDP-Api的合成，通常情况下植物细胞壁中木糖的含量远高于芹菜糖。对虎眼万年青(Ornithogalumcaudatum)的UXS与UAXS家族基因的克隆与功能分析发现，UXS与UAXS虽具有相似催化功能，但是两者的活性条件有所不同，金属离子的浓度与种类影响着UDP-木糖和UDP-芹菜糖最终的合成比例[15]。

植物木糖合成酶基因家族是催化植物UDP-糖基供体相互转化的关键酶，对其结构和功能的研究不仅能够为植物天然产物糖基化研究提供指导，而且有助于分析植物细胞壁的形成，各成分功能和人工改造细胞壁构造。目前，对植物的木糖合成酶基因家族的研究除了模式植物拟南芥[12-13,16]和水稻(Oryzasativa)[17-18]外，对一些经济作物和药用植物如大麦(Hordeumvulgare)[19]、马铃薯(Solanumtuberosum)[20]、虎眼万年青[15,21]等的木糖合成酶基因参与糖类代谢和糖基化产物合成的研究也较为深入。对木本植物木糖合成酶基因的研究仅见毛白杨(Populustomentosa)[22]、桃(Prunuspersica)[23]等，但对杉科植物的UXS与UAXS家族成员并没有报道。杉木(Cunninghamialanceolata)是我国南方林区主要的人工造林树种，具有速生、丰产、材质优良的特点[24]。同时，杉木的根、节、皮中的一些天然小分子糖基产物还具有重要的药用价值[25-27]。因此，对杉木木糖合成酶基因UXS/UAXS的克隆和表达研究，不仅有助于认识细胞壁初生壁和次生壁多糖的主要组分UDP-木糖和UDP-芹菜糖的合成和转化过程，也有助于了解杉木核苷糖基供体的合成和代谢途径，为杉木木材形成和代谢机制研究提供参考。本试验从杉木转录组中获取了木糖合成酶基因的中间片段，经过RACE基因全长克隆与qPCR表达分析，获得了杉木ClUAXS2基因的全长、结构和组织表达情况，研究结果为认识杉木ClUAXS2基因合成和转化UDP-木糖和UDP-芹菜糖的过程和途径提供了参考。

1 材料与方法

1.1 材料

杉木4号、25号、32号无性系1年生幼苗均采集于国家林业局杉木工程技术研究中心。采用水培法培养杉木幼苗1周后，采集幼苗根、茎和叶进行基因克隆和组织特异表达试验。采用RNAprep Pure Plant 植物总RNA提取试剂盒(北京天根生化科技公司)提取试验材料的总RNA，并采用Fermentas公司RT-PCR试剂盒合成cDNA第1条链，用于后续的基因克隆和基因表达验证试验。

1.2 杉木ClUAXS2基因全长的克隆

从前期获得的杉木茎转录组SRX2586188中筛选获得高表达丰度的Unigene 200084_g1的cDNA片段，在NR数据库中注释结果为推定的UDP-木糖/UDP-芹菜糖合成酶2(UDP-D-Apiose/ UDP-D-Xylose synthase 2)。根据转录组中cDNA片段利用Primer Premier 5.0软件设计序列验证引物A415F和A415R，对杉木茎cDNA进行PCR扩增(表1)。扩增产物经胶回收试剂盒(OMEGA)回收纯化后，与pMD18T载体进行连接转化得到阳性克隆并测序，获得目的基因核心片段。

目的基因的5′端与3′端序列克隆获取方式参考文献[28-29]。利用目的基因核心片段，采用Primer Premier 5.0软件设计3条特异性5′RACE引物和2条特异性3′RACE引物(表2)。使用SUPERSCRIPT II RT 酶和引物5′RACE-1 合成目的基因第一链cDNA，纯化经RNAase处理过的cDNA后，使用TdT酶和dCTP对纯化后的cDNA进行末端加上dC尾。使用引物5′RACE-2和桥连铆钉引物AAP对已经加dC尾的纯化cDNA进行第1轮PCR扩增，然后再使用引物5′RACE-3和桥连通用扩增引物AUAP进行巢式PCR第2轮扩增，对扩增后的PCR产物进行测序后获得目的基因的5′端序列。使用试剂盒中的逆转录酶和引物3′CDS primer A对杉木总RNA进行逆转录合成模板cDNA，使用特异性引物3′RACE-1和 UPM进行3′端的第1轮PCR扩增。对扩增产物进行稀释50倍处理，并使用引物3′RACE-2和 UPM对稀释后的扩增产物进行第2轮PCR扩增，收集第2轮扩增产物进行测序，获得目的基因的3′端序列。

根据获得的目的基因核心片段、5′RACE片段和3′RACE片段的序列信息，将3段序列通过软件Vector NTI 10.3.0拼接后，获得Unigene 200084_g1的全长cDNA 序列。引物合成与阳性结构测序均由生工生物工程(上海)股份有限公司进行。

表1 PCR反应程序Table 1 PCR reaction program

表2 全长克隆引物序列Table 2 Full length cloned primer sequence

1.3 ClUAXS2基因生物信息学分析

采用NCBI提供的ORF finder程序分析基因的开放阅读框ORF；采用DNAMAN软件进行序列分析和编码氨基酸翻译；使用ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)分析蛋白的理化性质与氨基酸组成；使用ProtScale(http://web.expasy.org/protscale/)预测蛋白疏水性；通过SignalP4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)预测编码蛋白信号肽、采用NetPhos2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos-2.0/)预测分析蛋白磷酸化位点、使用TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)对蛋白的跨膜结构区域进行预测分析；利用PredictProtein(https://ppopen.informatik.tu-muenchen.de/)预测蛋白的二级结构，使用SWISS-MODEL(https://www.swissmodel.expasy.org/)建模预测蛋白的三级结构。通过NCBI的BLAST工具(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行氨基酸同源性分析；利用ClustalX2.0软件进行氨基酸的多序列比对，使用MEGA5.0软件中的邻位相连法(Neighbor-joining)构建系统发育树[30-32]。

1.4 ClUAXS2基因表达分析

使用Promega公司的qPCR Master Mix试剂盒，在StepOnePlus Real-Time PCR System仪器上进行荧光定量PCR，分析目的基因在杉木4号、25号、32号家系根、茎、叶中的表达情况，并设置3次生物学重复。根据目的基因的非保守区设计荧光定量引物为ClUAXS2-F：5′-TCCTCTGGTGGCAA- TTCTGT-3′和ClUAXS2-R：5′-GGAGCCCTGATGATGATCGA-3′。选择β-Actin基因为内参基因，其引物为β-Actin-F：5′-TACATTGCCGGTGTATTGAACGTC-3′和β-Actin-R：5′-AGTTGCTCCAGAAGAACATCC-3′。PCR反应程序为： 95℃预变性3 min； 95℃变性20 s， 60℃退火30 s， 72℃延伸30 s，共45个循环；95℃ 30 s，60℃ 30 s，逐渐升温到95℃，速度为0.11℃·s-1；采用Q=E-△△CT法来计算目的基因的相对表达水平，E为使用默认值2[28-29]。

2 结果与分析

2.1 ClUAXS2基因全长的克隆

选取32号杉木茎的cDNA为模板，根据Unigenes c200084_g1基因核心序列设计特异引物进行PCR反应来验证目的基因序列， PCR产物回收测序获得了长度为1 161 bp的目的基因保守cDNA序列(图1a)。根据目的基因保守cDNA序列，进行目的基因5′RACE和3′RACE扩增测序，获得223 bp的5′端片段(图1b)，以及475 bp的3′端片段(图1c)；将目的基因的中间序列、5′端片段和3′端片段通过软件拼接后，获得1条完整长度为1 634 bp的cDNA序列。通过NCBI的blastx方法比对相似序列，发现杉木c200084_g1基因所编码的蛋白与其他植被UDP-木糖基因的编码蛋白UDP-D-Apiose/ UDP-D-Xylose synthase 2(UAXS2)的相似性均>80%，因此将目的基因命名为杉木木糖合成酶基因ClUAXS2。

2.2 ClUAXS2基因生物信息学分析

2.2.1ClUAXS2基因序列分析 利用ProtParam在线分析杉木ClUAXS2基因编码蛋白的理化性质，结果表明ClUAXS2基因总长度1 643 bp，包含1 158 bp的开放阅读框，编码1个含386个氨基酸的蛋白质，其中49个为酸性氨基酸，39个为碱性荷氨基酸，其余中性氨基酸，且异亮氨酸(8.8%)和亮氨酸(8.5%)含量最多。ClUAXS2基因编码蛋白理论分子量为43.50 ku，等电位点为5.60(表明酸性氨基酸多于碱性氨基酸)；分子式组成为C1936H3026N524O578S19，不稳定系数为47.84，属于不稳定蛋白；脂肪系数为85.91，评价表明总平均亲水性为-0.318。使用ProtScale软件中的Hphob./Kyte&Doolittle方法分析预测ClUAXS2基因编码蛋白的亲/疏水性。结果显示，ClUAXS2基因的编码蛋白中亲水区域多于疏水区域；同时，第16位氨基酸处为疏水区最大值2.222，亲水区最小值为第333位氨基酸的-2.767，因此判断该编码蛋白为亲水蛋白(图2)。

图1 杉木ClUAXS2基因琼脂糖凝胶电泳图(a：保守cDNA；b：5′RACE；c：3′RACE)Fig.1 Cunninghamia lanceolata ClUAXS2 gene′s agarose gel electrophoresis (a：conserved sequence cDNA；b：5′RACE；c：3′RACE)

2.2.2ClUAXS2基因编码蛋白信号肽与跨膜结构分析 在线软件SignalP4.1通过分析ClUAXS2基因编码的氨基酸序列中各个氨基酸的信号肽分值，预测分析该氨基酸序列是否存在信号肽，结果显示，主要有原始剪切点分值(Cscore)、综合剪切点分值(Yscore)以及信号肽值(Sscore)，其中当最大Y值>阙值0.45时，判定该编码蛋白存在信号肽。结果表明第1～10位氨基酸的平均Sscore为0.156，第11位氨基酸Y值最大，为0.133，均<阙值0.45；且1～10位氨基酸平均信号肽和最大剪接位点分值的平均为0.145，同样<阙值0.45，因而推测ClUAXS2基因编码蛋白不具有信号肽，不是分泌型蛋白(图3)。ClUAXS2基因具有明显的UAXS基因家族共同的保守结构域和保守的氨基酸位点，如“GxxGxxG”NAD+结合区，“YxxxK”保守区、丝氨酸、苏氨酸位点等。使用在线软件NetPhos2.0预测分析ClUAXS2基因编码蛋白的氨基酸位点(图4)。结果表明，ClUAXS2基因编码蛋白具有9个丝氨酸(Ser)磷酸修饰位点，4个苏氨酸(Thr)磷酸修饰位点以及3个酪氨酸(Tyr)磷酸修饰位点。TMHMM Server在线软件预测ClUAXS2基因编码蛋白跨膜结构表明，该编码蛋白仅具有1个疑似跨膜区域，位于第11～31位氨基酸残基范围内(图5)。

图2 ClUAXS2基因亲/疏水性曲线Fig.2 Hydrophilic / hydrophobic curves of ClUAXS2 gene

图3 ClUAXS2基因信号肽分析与预测Fig.3 Analysis and prediction of signal peptide of ClUAXS2 gene

2.2.3ClUAXS2基因蛋白结构预测分析 使用PredictProtein工具预测ClUAXS2基因编码蛋白的二级结构，结果显示该编码主要结构为无规则卷曲Loop环，占该蛋白二级结构总体的50.26%，其次为34.97%的α-螺旋，以及14.77%的β-折叠。通过在线软件SWISS-MODEL预测ClUAXS2基因编码蛋白的三级结构(图6)，发现构成该蛋白质的主要三级骨架是α-螺旋和Loop环。且ClUAXS2基因编码蛋白总共有8个可能的二硫键形成位点，亚细胞定位预测显示位于细胞质中。二级结构预测中，还显示ClUAXS2基因编码蛋白具有4个功能蛋白位点，分别为7个磷酸化位点，5个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点，2个酪氨酸激酶磷酸化位点和5个N酰基化位点。

图4 ClUAXS2基因磷酸化位点分析与预测Fig.4 Analysis and prediction of phosphorylation sites of ClUAXS2 gene

图5 ClUAXS2基因跨膜区域预测Fig.5 Transmembrane domain prediction of ClUAXS2 gene

图6 ClUAXS2基因编码蛋白三级结构图Fig.6 Three level structure map of coding protein of ClUAXS2 gene

2.2.4ClUAXS2基因蛋白序列同源性分析 通过NCBI中的BLASTP工具对ClUAXS2基因蛋白序列进行检索与比对，结果显示其属于UAXS基因家族。使用软件ClustalX2.0和MEGA5.0对ClUAXS2基因以及与其同源性较高的其他物种UAXS进行氨基酸多序列比对，并构建系统进化树(图7)。结果表明，ClUAXS2基因编码氨基酸与其他物种相似性均在80%以上，其中与无油樟(Amborellatrichopoda)和可可树(Theobromacacao)的相似度达到85%、86%，与拟南芥、葡萄(Vitisvinifera)、毛果杨(P.trichocarpa)的相似度均为84%。对比杉木与其他物种的木糖合成酶基因发现，其中有16个长度超过5个氨基酸序列且序列完全一致的(深色阴影部分)，最长为177～194共18个氨基酸(图8)。

注：GenBank登录号：琴叶拟南芥XP_020883807.1；拟南芥NP_563807.1；油菜XP_013657587.1；毛果杨XP_006384681.1；木薯XP_021611295.1；橡胶树XP_021640429.1；芝麻XP_011088822.1；菠菜XP_021843735.1；番茄NP_001296729.1；马铃薯NP_001275341.1；可可树EOY33604.1；甜樱桃XP_021812132.1；桃XP_007205322.1；木豆XP_020230997.1；蔓花生XP_015935869.1；葡萄AEP17006.1；菠萝XP_020110718.1；浮萍AOG75416.1；无油樟XP_006851788.1。

图7ClUAXS2基因系统发育进化树
Fig.7 Phylogenetic tree ofClUAXS2 gene

2.3 ClUAXS2基因组织特异表达分析

采用实时荧光定量PCR检测ClUAXS2基因在杉木4号、25号、32号无性系各个组织的表达情况，检测显示杉木ClUAXS2基因在其根、茎与叶中均有表达，其中ClUAXS2基因在茎中的相对表达量最高(图9)。ClUAXS2基因在4号和32号杉木叶中的相对表达量要高于在根中的相对表达量；在25号杉木根中的相对表达量要高于在叶中的相对表达量。ClUAXS2基因在杉木4号、25号、32号无性系茎中的相对表达量不存在显著差异(P>0.05)。ClUAXS2基因在杉木25号无性系根中的相对表达量与在杉木32号、4号无性系根中的相对表达量存在显著差异(P<0.05)；ClUAXS2基因在杉木32号无性系叶中的相对表达量与在杉木25号、4号无性系叶中的相对表达量存在显著差异(P<0.05)，这可能与杉木无性系间木糖、芹菜塘合成相关的代谢活性不同有关。

3 结论与讨论

UAXS是植物体内可同时催化UDP-葡萄醛酸合成UDP-木糖和UDP-芹菜糖的双功能酶，其结构和功能的完整性对植物体内木糖、芹菜糖的合成、分配和平衡都是非常重要的。以UDP-葡萄醛酸(UDP-D-GlcA)为底物，加之辅酶NAD+，UAXS可以将UDP-葡萄醛酸转化成为UDP-木糖；同时，在UAXS作用下，通过脱羧反应与碳骨架重新排列，底物UDP-葡萄醛酸转化为UDP-木糖的反应中同时有UDP-芹菜糖产生。植物体内木糖的含量往往远超过芹菜糖，如桦木(Betula)中木糖的含量占全部核苷糖总量的30% 以上，而在一些松类植物上的含量却<9% ；UDP-芹菜糖则是仅在高等植物细胞壁中存在的罕见支链五碳糖。本试验利用全长克隆方法和PCR技术，从杉木中克隆获得了1个编码杉木木糖合成酶蛋白的基因ClUAXS2，包含1 643 bp全长cDNA序列，其中包括1 158 bp的开放阅读框。杉木ClUAXS2基因编码的木糖合成酶蛋白分子量为43.5 ku，与已报道的虎眼万年青的OcUAXS1/2的44.1、43.9 ku相似，不同于早前拟南芥中的AtAXS1/2。ClUAXS2基因编码的蛋白没有跨膜区，无信号肽且存在于细胞质中，均与AtAXS1/2、OcUAXS1/2相同，且同样具有“GxxGxxG”NAD+结合区，“YxxxK”保守区，是植物细胞壁合成途径中的重要糖苷蛋白。qPCR结果表明，ClUAXS2基因在杉木根、茎与叶中均有表达，在杉木茎中的相对表达量在各个组织中最高。ClUAXS2基因在不同无性系茎中的相对表达量不存在显著差异，而在根与叶中的相对表达量存在一定的差异，这可能与杉木无性系间木糖、芹菜塘合成相关的代谢活性不同有关。

图8 ClUAXS2基因编码氨基酸序列Fig.8 Coded amino acid sequence of ClUAXS2 gene

注：相同组织部位比较中，不同字母表示存在显著差异(P<0.05)，相同字母表示不存在显著差异(P>0.05)。

图9ClUAXS2基因在不同杉木组织中的相对表达量
Fig.9 Expression analysis ofClUAXS2 genes in different tissues ofC.lanceolata

UAXS基因家族对于植物细胞壁结构的正常合成和代谢具有重要意义，缺乏UAXS可以导致植物细胞与细胞壁结构异常或死亡。J.W.Ahn[14]等曾利用病毒诱导使烟草中的木糖合酶基因NbAXS1沉默，发现该基因亚细胞定位于细胞质中，同时由于NbAXS1基因的沉默烟草的生长有明显的缺陷，大量细胞死亡[14]。因此，植物细胞UAXS基因功能的缺失会引起植物木糖代谢功能受阻，从而导致植物细胞壁结构发育异常。同时，UDP-芹菜糖作为RG-Ⅱ与硼酸结合部位的附着点，缺失UAXS会导致植物缺少UDP-芹菜糖而减少与硼酸盐交联，则会引起细胞壁增厚，生长受到抑制[14]。在虎眼万年青中发现OcUAXS1/2基因是虎眼万年青多糖代谢途径中重要的一环，对于植物体内木糖和芹菜糖的代谢平衡至关重要，进而影响细胞壁合成和结构的完整[15,21]。同时，UAXS编码合成的UDP-木糖还可以作为重要的糖基供体，参与许多植物中生物活性物质和药用糖苷类物质的合成。木薯(Manihotesculenta)的MeUAXS2可用于将合成淀粉的葡萄糖转入合成其他代谢糖类[33]，虎眼万年青中的OcUAXS2参与虎眼万年青抗癌多糖的合成[21]。本研究从杉木中克隆获得了一个在杉木各组织中稳定表达的UAXS基因家族成员ClUAXS2，研究结果对于认识和理解杉木UDP-木糖/芹菜糖的合成和代谢过程奠定了基础。目前，对于杉木UXS和UAXS基因的家族成员、合成过程和代谢机制研究还尚未深入，其研究结果不仅有助于认识杉木细胞壁多糖的合成过程，也有助于发掘杉木功能性糖苷类物质的代谢过程。

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