海洋放线菌酰胺酶AM合成基因的克隆

◎ 马艳玲，李海贤，翁 萍，刘泽璇，许小庆，曾 荣

（佛山科学技术学院食品科学与工程学院，广东 佛山 528231）

放线菌与人类的生产和生活息息相关，是很多天然药物和生物活性物质的重要来源[1]。海洋放线菌产生了许多具有特殊化学结构以及特殊生理活性和生理功能的物质[2]。尽管海洋放线菌的类群和数量都非常可观，但很多研究者使用经典的分离培养方法培养却失败了[3]。近年来，从海洋放线菌中陆续发现的SalinosporamideA等一系列新的活性化合物，均可证明海洋是一个具有极大地潜力的资源宝库[4-7]。因此，本研究旨在以稀有海洋放线菌Salinispora arenicola CNS-205为实验材料，克隆出海洋放线菌酰胺酶AM的完整基因，以为该基因簇的功能研究奠定基础。

1 试验材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌种来源

海洋放线菌Salinispora CNS-205分子生物学实验室保存。

1.1.2 主要试剂

大肠杆菌DH10B；限制性内切酶NdeI和EcoRI；DNA分子标准量marker；DNA聚合酶。DNA提取试剂盒，T4DNA连接酶，凝胶回收试剂盒，质粒小提试剂盒等，均购买自天根生化科技（北京）有限公司；其余均为国产分析纯试剂。

1.2 试验方法

1.2.1 重组质粒的构建

PCR反应体系：H2O 28.5 μL，5×FAST HiFidelity PCR Buffer 10 μL，20×FAST PCR Enhancer 2.5 μL，DMSO 2 μL，Template 2 μL，PrimerL 2 μL，PrimerR 2 μL，FAST HiFidelity polymerase 1 μL。PCR 程序：升温90 ℃，2 min；DNA变性95 ℃，30 s；退火53 ℃，30 s；延伸72 ℃，2 min；30个循环后，72 ℃维持10 min，电泳。PCR产物的片段为双链平末端，需通过酶切的方式将黏性末端暴露出来。酶切反应体系如下（50 μL反应体系）：

然后放入37 ℃水浴锅中水浴2 h，经胶回收后的PCR产物连入pUC-18载体。

酶连体系（20 μL反应体系）：

1.2.2 酶切验证

用EcoRI和NdeI酶切，酶切反应体系如下（10 μL反应体系）：

2 试验结果与分析

2.1 目的基因的PCR扩增

以海洋放线菌总DNA为模板，用上述引物进行扩增，再EcoRI和NdeI酶切回收。原PCR产物的目的条带应位于大约1 800 bp处，如图1所示。

图1 PCR电泳图

2.2 重组质粒的验证

图2中第一个条带约在2 700 bp左右，为载体的酶切条带；第二个条带位于1 800 bp左右，为目的基因的酶切条带。得出该重组质粒后，测序委托南京金斯瑞生物科技有限公司完成。

图2 酶切验证图

3 讨论

酰胺酶的酰基转移活性能催化底物生成其相对应的异羟肟酸，异羟肟酸可作为食品添加剂、生长因子、抗白血病、抗肺结核病、肿瘤抑制因子等药物，是极为重要的可用于化学治疗的物质，具有重要的生物学活性。其金属离子的螯合作用还可以为微生物所吸收利用，在金属离子匮乏的环境中具有重要的意义[8]。

[1]W Fenical，PR Jensen. Developing a new resource for drug discovery: marine actinomycete bacteria[J].Nature Chemical Biology，2006，2（12）：666-673.

[2]侯艳华.四株海洋放线菌遗传转化体系的研究[D].青岛：中国科学院研究生院，2006.

[3]田 新，朋张偲，李文均.海洋放线菌研究进展[J].微生物学报，2011，51（2）：161-169.

[4]马艳玲.海洋放线菌基因组文库的构建和功能基因的克隆及序列分析[D].武汉：华中师范大学，2011.

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