儿童抗病毒颗粒质量标准研究

崔庆艳，杨怀雷，刘敏，倪淑玲，王永生※

（1.吉林大学药学院，长春 130021；2.吉林省人参研究院，长春 130117）

儿童抗病毒颗粒是以大青叶为君药，黄芩、柴胡和金银花为臣药组成的中药复方制剂，具有清热解毒、泻火升阳等药效，主要用于治疗儿童由于病毒性感染引发的高热寒战、咳嗽咽痛、头痛乏力等症状，且疗效缓和稳定[1]。本试验分别通过薄层色谱（TLC）法和高效液相色谱（HPLC）法对该处方中的主要有效成分进行定性鉴别和定量分析，进而建立儿童抗病毒颗粒的质量标准。

1 仪器与材料

1.1 仪器

1260 HPLC（美国安捷伦公司）；FA1104天平（上海精密科学仪器有限公司）；ZF-1手提式紫外灯（上海越众仪器设备有限公司）；RE-52-99旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；DZF-6050真空干燥箱（上海博讯实业有限公司）；GZX-9140MBE电热鼓风干燥箱（上海博讯实业有限公司）。

1.2 材料

儿童抗病毒颗粒（吉林大学紫元天然药学化学研究室自制）；靛玉红对照品110717-200204、靛蓝对照品110716-201111、柴胡皂苷对照品110718-200805、黄芩素对照品 111595-201306、黄芩苷对照品110715-201318、汉黄芩素对照品111514-201304、绿原酸对照品110713-200911（中国食品药品检定研究院）；硅胶G板（青岛海洋化工厂）；聚酰胺薄膜（上海越众仪器设备有限公司）；甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 薄层鉴定

2.1.1 大青叶薄层鉴定[2，3]取儿童抗病毒颗粒样品2.0g，加入10mL甲醇和30mL乙酸乙酯作为提取溶剂，加热回流提取30min，放冷，过滤，将滤液真空干燥至干，残渣加甲醇溶解并定容至5mL，作为供试品溶液。另取不含大青叶的颗粒采用同法制得阴性对照品溶液。分别精密称取靛蓝对照品和靛玉红对照品适量，加入10mL三氯甲烷溶解定容即得混合对照品溶液。

分别取上述供试品溶液和阴性对照品溶液5L、对照品溶液2L，在同一硅胶板上分别点样，以苯-三氯甲烷-丙酮（v∶v∶v=4∶3∶1）为展开剂展开，用吹风机低温小风速吹干，在日光下观察。结果在对照品斑点的相应位置，供试品溶液也出现相同颜色的两个斑点，且斑点清晰，阴性对照无干扰，可以定性鉴别该处方中的大青叶。

2.1.2 黄芩薄层鉴定[4]取儿童抗病毒颗粒样品3.0g，加20mL甲醇和40mL乙酸乙酯，回流提取30min，冷却，过滤，将滤液真空干燥至干，残渣加甲醇溶解并定容至5mL，作为供试品溶液。另取不含黄芩的颗粒采用同法制得阴性对照品溶液。分别精密称取黄芩素对照品、黄芩苷对照品、汉黄芩素对照品适量，加入10mL甲醇溶解并定容，即得3种对照品溶液。分别取上述供试品溶液、阴性对照溶液5L，3种对照品溶液各2L，在同一硅胶G薄层板上点样，以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（v∶v∶v∶v=9∶3∶1∶2）为展开剂展开，自然状态下晾干，在365nm紫外灯下观察。结果供试品溶液在各对照品斑点的相应位置上，分别显示出颜色相同的斑点，且阴性对照无干扰，可以鉴别该处方中的黄芩。

2.1.3 柴胡薄层鉴定[5，6]取儿童抗病毒颗粒样品2.0g，加入40mL甲醇超声20min后过滤，滤液蒸干，残渣加甲醇溶解并定容至5mL，即得供试品溶液，另取不含柴胡的颗粒2.0g，同法制得阴性对照品溶液。精密称取柴胡皂苷对照品适量，加甲醇溶解得对照品溶液。分别取以上3种溶液各5L，在同一硅胶板上点样，以氯仿-乙醇-水（v∶v∶v=20∶6∶1）为展开剂展开，自然状态下晾干，喷以含4%对甲氨基苯甲醛的40%硫酸溶液作为显色剂，在60℃下加热直至斑点显现清晰后在365nm紫外灯下观察。结果，供试品和对照品在硅胶板相同的位置上出现相同颜色的斑点，可以鉴别制剂中的柴胡药材。

2.1.4 金银花薄层鉴定[7]取儿童抗病毒颗粒样品2.0g，加入10mL甲醇超声提取30min，过滤即得供试品溶液。另取不含金银花的样品颗粒2.0g，按同法制得阴性对照品溶液。精密称取绿原酸对照品适量，加甲醇配制10.05mg/mL的对照品溶液。分别取上述溶液各5L，在同一硅胶板上点样，以醋酸乙酯-甲酸-水（v∶v∶v=8∶4∶1）为展开剂展开，自然状态下晾干，在紫外灯（365nm）下观察。结果供试品在对照品斑点相应的位置显示相同颜色的斑点，且阴性对照无干扰。

2.2 含量测定

2.2.1 色谱条件[8]色谱柱：AgilentTC-C18柱（4.6mm×250mm，5m）；流动相：甲醇-水（v∶v=75∶25）；柱温：30℃；流速：1mL/min；进样量：10L；检测波长：289nm。

2.2.2 对照品溶液制备 精密称取靛玉红对照品适量至10mL容量瓶中，加入甲醇定容至刻度，配制成浓度为0.3024mg/mL的对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液制备 精密称取儿童抗病毒颗粒样品1.0g左右，加入30mL甲醇加热回流提取3h。将提取液蒸干，残渣中加入甲醇适量溶解，将上述溶液转移至50mL容量瓶中并定容至刻度，过滤取续滤液即得供试品溶液。

2.2.4 阴性对照品溶液的制备 取不含大青叶的组方药材按“2.2.3”项下方法制得阴性对照品溶液。

2.2.5 测定 精密吸取供试品溶液、对照品溶液和阴性对照品溶液各10L，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定。在对照品色谱图出峰的保留时间位置上，供试品溶液色谱图也出现相应的色谱峰，且阴性对照品色谱图无干扰。结果见图1。

图1 阴性样品、靛玉红对照品及样品色谱图Fig.1 Negative sample solution，Indirubin reference substance and Sample solution chromatogram

2.2.6 线性关系考察 精密量取“2.2.2”项下靛玉红对照品溶液适量，分别加入不同体积的甲醇进行稀释，制得浓度分别为0.806g/mL、1.610g/mL、3.129g/mL、6.438g/mL、9.185g/mL和12.264g/mL的对照品溶液。分别精密吸取上述对照品溶液按照“2.2.1”项下色谱条件进样测定，以峰面积积分值为纵坐标、进样量为横坐标绘制标准曲线，标准曲线见图2。结果得标准曲线方程为Y=16.38X+0.028 8，R2=0.999 9，靛玉红在0.806g/mL～12.264g/mL范围内呈现良好的线性关系。

图2 靛玉红对照品标准曲线Fig2 The standard curve of Indirubin reference

2.2.7 精密度试验 取同一对照品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，每次进样20L，连续进样6次，记录色谱峰面积，结果得RSD值为0.85%，表明仪器精密度良好。

2.2.8 重复性试验 取同一批儿童抗病毒颗粒样品6份，每份2.0g，按“2.2.3”项下方法制备供试溶液。另取靛玉红对照品适量，按“2.2.2”项下方法制备对照品溶液。分别精密量取上述供试品溶液和对照品溶液20L，按照“2.2.1”项下色谱条件进样，记录色谱峰面积，RSD值为0.78%。结果表明本方法重复性良好。

2.2.9 稳定性试验 精密称取儿童抗病毒颗粒样品2.0g左右，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，并于0h、4h、8h、12h、16h、20h、24h分别在高效液相色谱仪进样20L，记录色谱峰面积，测得RSD值为1.12%，结果表明样品溶液在24h内稳定性良好。

2.2.10 加样回收率试验 精密称取已知靛玉红含量的儿童抗病毒颗粒样品6份，每份1.0g，加入适量的靛玉红对照品，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，并按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱峰面积，计算得平均回收率为100.07%，RSD值为0.90%，结果表明本方法具有良好的回收率。结果见表1。

表1 靛玉红加样回收率试验结果Tabble 1 The add sample recovery test results of the indirubin

2.2.11 样品中靛玉红含量测定 分别称取不同批次的6个儿童抗病毒颗粒样品，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，另精密称取靛玉红对照品适量，按“2.2.2”项下色谱条件制备对照品溶液。分别将上述供试品溶液和对照品溶液按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，计算得平均含量为0.019 5%。结果见表2。根据实际装样情况，规定每袋儿童抗病毒颗粒中靛玉红的含量不得低于0.5mg。

表2 6批次儿童抗病毒颗粒样品中靛玉红的含量测定Table 2 Indirubin determination in the 6 bathes of children antiviral particles results

3 讨论

本实验分别对展开系统条件、点样量、检视条件进行考察，建立了儿童抗病毒颗粒中的大青叶、黄芩、柴胡的薄层色谱定性鉴别方法，分离度好，专属性强，阴性对照无干扰，可以有效地鉴定组方药材。

根据2015版《中国药典》中靛玉红含量测定方法的条件进行测定，并不能很好地将靛玉红与其他成分分离，故在此基础上优化色谱条件[9]。流动相甲醇∶水（v∶v）为75∶25、检测波长为289nm时，靛玉红能完全分离且峰形较好，塔板数符合要求且保留时间适宜，故选定以上色谱条件。

本实验分别通过TLC法和HPLC法对儿童抗病毒颗粒进行定性鉴别和定量分析，结果表明，本方法专属性好、精确度高、操作简便可行，能迅速准确地对该制剂的质量标准进行分析，故可通过本方法控制儿童抗病毒颗粒的质量检验指标。

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