Atlantis®T3色谱柱检测保健酒中西地那非和他达拉非的含量

◎ 张建炀，杨 坤，唐国芳

（贵州省黔东南州食品药品检验检测中心，贵州 凯里 556000）

随着社会经济的不断发展和人民生活水平的不断提高，人们对于保健品的需求不断增长，特别是保健酒的需求也不断上升。为了使保健酒的功效显著，一些不法商贩人为地添加西药成分以达到宣称的具有纯中药成分的保健酒[1]。由于制造工艺、含量均匀性差和配料表里未标注其添加成分含量，给消费者的健康带来巨大的安全危害[2-3]，如过量服用这些非法添加的保健酒，轻者会引起头痛、消化不良、颜色分辨下降等不良反应，对于心血管患者，严重者可能导致突然死亡[4-5]。

文献报道的西地那非和他达拉非检测方法主要有高效液相色谱法（HPLC）、薄层色谱法（TLC）及液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）等[6-7]，测定保健酒的报道很少。目前，国家食品药品监督管理局批准件[8]针对检测西地那非和他达拉非的高效液相色谱法存在色谱峰型差，流动相酸度大及液质联用系统容易受样品污染等问题，很难准确达到分离定性问题。Waters Atlantis®T3色谱柱是基于超纯硅胶基质的反相C18色谱柱，用于保留和分离强极性化合物，并且在很宽的pH值范围内保持卓越性能，对于复杂的样品有优良的分离。针对普通C18柱很难分离西地那非和他达拉非，目标峰型差、半峰很宽，并且洗脱溶剂需要用磷酸调pH值到2.8，低pH值容易损伤色谱柱，降低色谱柱分离能力等问题，本文以Waters Atlantis®T3作为色谱柱，用甲醇和10 mmol/L的乙酸铵作为流动相进行梯度洗脱，最大程度降低对色谱柱的损害，并对目标物进行全波长扫描，以达到定性的目的。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

西地那非（中国食品药品检定研究院，CAS号139755-83-2，纯度99.9%），他达拉非（中国食品药品检定研究院，CAS号171596-29-5，纯度99.9%），乙腈、甲醇（色谱纯，美国Fisher公司），乙酸铵（色谱纯）。

Thermo Ulimate 3000高效液相色谱仪（配DAD检测器，变色龙7.1色谱工作站，Thermo公司），AB API4000+超高效液相色谱/串联四级杆质谱联用系统（配电喷雾离子源（ESI），美国AB SCIEX公司），Centrifuge5702离心机（德国eppendorf公司），Talboys旋涡混合器，Milli-Q纯水仪（美国Millipore公司），MS205DU电子天平（美国梅特勒-托利多仪器公司）。

1.2 方法

1.2.1 液相色谱条件

色谱柱：Atlantis®T3（Waters，4.6 mm×250 mm，5 µm）；流速1.0 mL/min；柱温35 ℃；进样量10 µL；检测波长230 nm；流动相：溶剂A为甲醇，溶剂B为0.01 mol/L的乙酸铵（见表1）。

表1 梯度洗脱表

1.2.2 标准溶液的配制

1.2.2.1 标准贮备液的配制

精密称取西地那非、他达拉非标准品各10 mg，置于50 mL的容量瓶中，用乙腈稀释定容至刻度，摇匀即得，避光储存于2～5 ℃的冰箱中。

1.2.2.2 标准品使用液的配制

精密吸取1.00 mL标准品贮备液，定容至10.0 mL容量瓶，配制成含西地那非和他达拉非各20 µg/mL的标准品使用液。

1.2.2.3 工作曲线的配制

准确吸取 1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mL和10.0 mL分别置于10 mL容量瓶，用乙腈配制成含2.0、4.0、8.0、12.0、16.0 µg/mL和20.0 µg/mL的混合标准溶液。

1.2.3 样品制备

准确称取试样约10.0 g，于50 mL离心管中，加乙腈30 mL，以2 500 r/min漩涡混合10 min，加乙腈定容至刻度，以3 000 r/min离心5 min，再用0.45 µm微孔有机滤膜过滤于进样瓶中供HPLC分析。

2 结果与讨论

2.1 液相色谱条件的优化

2.1.1 色谱柱的选择

分别选用Thermo Hyperall C18、Dikma Diamonsil C18、Waters Symmetry Shield RP18 和 Waters Atlantis®T3 C18色谱柱分析西地那非和他达拉非。结果表明，Waters Atlantis®T3 C18色谱柱可以获得良好的分离度和峰型，并且样品中其他杂质对主峰无干扰。

2.1.2 流动相的选择

为使分离效果达到最佳，分别选择用甲醇+乙腈+磷酸三乙胺溶液、甲醇+水、甲醇+乙酸铵溶液作为流动相，以不同比例溶剂梯度洗脱分离西地那非和他达拉非。结果表明，采用甲醇+乙腈+磷酸三乙胺溶液峰型很差，基线漂移大；采用甲醇+水作为流动相峰型好，但分离度不是很好，而且基线不稳；采用甲醇+0.01 mol/L乙酸铵作为流动相峰型、分离度好，基线比较平稳。几种流动相条件下分别进20 µg/mL混合对照品，色谱图按顺序见图1。

图1 不同流动相条件下西地那非和他达拉非色谱图

2.1.3 检测波长选择

提取西地那非和他达拉非标准溶液在200～400 nm的紫外光谱扫描图，发现其在波长220～230 nm处有较大的吸收且基线平稳，故采用230 nm作为检测波长。光谱图见图2。

图2 西地那非和他达拉非光谱图

2.2 结果

2.2.1 线性方程和检出限

将标准系列溶液依次进样，进样量为10 µL，以浓度为横坐标、峰面积为纵坐标，用Orign7.5软件对标准系列进行线性回归得西地那非和他达拉非标准系列（2.0～20µg/ml）的回归方程分别为Y=0.504 65X+0.114 41，R=0.999 86和Y=0.429 44X+0，R=0.999 99，结果见图3，西地那非和他达拉非在上述浓度内线性关系良好。当取样量为10.0 g时，信噪比S/N≥3时，确定其检出限LOD分别为0.82 mg/kg和0.94 mg/kg。

图3 西地那非和他达拉非标准曲线图

2.2.2 精密度和回收试验

用本实验方法对8款保健酒样品进行测定，样品中均未检出西地那非，有一样品中疑似检出他达拉非。经光谱图对比后发现不是他达拉非，见图4，同时用液质联用仪进行确认。在阴性样品中分别添加西地那非和他达拉非标准品0.1～0.5 mg/kg，进行加标回收试验，结果见表2。

图4 样品中疑似他达拉非成分的光谱图

表2 加标回收试验结果表

由表2可知，西地那非的回收率为96.0%～102.0%，他达拉非的回收率为90.0%～96.6%，测定结果的相对标准偏差均小于1%，表明所建立的分析方法的精密度和准确度均较高，满足检测要求。

2.2.3 LC-MS/MS确认

（1）色谱条件。色谱柱：Waters Symmetry Shield RP（100mm×2.1mm，5µm）；流速0.4 mL/min；进样量10 µL；流动相：A为0.1%甲酸的甲醇；B为0.1%甲酸的10 mmol/L乙酸铵；梯度洗脱程序见表3。

表3 梯度洗脱程序表

（2）质谱参数。西地那非和他达拉非采用正离子检测方式（ESI+），质荷比范围：m/z 50～500；毛细管电压2.8 kV，锥孔电压55 V，离子源温度500 ℃，采用全扫描一级质谱、选择离子二级全扫描质谱检测方式。

（3）测定结果。将1.2.2.3项下混合标准品溶液和2.2.2项下阳性供试品溶液按上述条件进行UPLC-MS/MS分析，未检测到样品与西地那非和他达拉非标准品相同保留时间的一级质谱和二级质谱图。

2.3 讨论

本文选用Atlantis®T3 C18色谱柱在不同流动相条件对保健酒中的西地那非和他达拉非进行测定，在流动相为甲醇+0.01 mol/L乙酸铵进行梯度洗脱时，保健酒中西地那非和他达拉非检测灵敏度高，基线平稳，选择性较好，不用对流动性进行调pH值，有效延长色谱柱的使用寿命；同时利用DAD扫描图对标准品和样品进行对比，可以有效降低假阳性率，适用于实际工作中保健酒里西地那非和他达拉非的检测。

[1]蔡振世，徐端琼，卢文斌.补肾壮阳类保健品中非法添加物检测方法在国内的研究进展[J].海峡药学，2016（7）：61-64.

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[3]叶兰凤，叶晓娟，陈丽湘.高效液相色谱-串联质谱法测定保健食品中西地那非、他达拉非和伐地那非[J].海峡药学，2013（12）：123-125.

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[8]国家食品药品监督管理局.药品检验补充检验方法和检测项目批准件编号2009030[Z].2009.