趋化因子17对人鼻咽癌干细胞转移分化能力的影响

李建民 王丽萍 白伟良

(青海大学附属医院耳鼻喉科，青海 西宁 810001)

鼻咽癌是常见的呼吸系统恶性肿瘤疾病之一，是侵袭性较强的头颈部恶性肿瘤，极易发生淋巴结转移及肝肺等远处转移，影响患者全身多处器官，可严重影响患者的健康和生存质量，甚至引发死亡等不良预后的发生〔1～3〕。趋化因子(CCL)是可趋化细胞定向移动的小分子肽，其中的CCL17是与免疫微环境密切相关的因子，CCL可通过与CCL4结合而引发分子构象的改变，导致细胞外的钙离子内流和细胞贮存的钙离子释放，引发细胞质内钙离子浓度的明显增加，引发靶细胞反应，从而参与白细胞的迁移并起到调节炎症和调节免疫细胞分化的作用，促进血管重塑〔4～6〕。因此，趋化因子17亦可能是与鼻咽癌等肿瘤血管生成、侵袭转移及分化等相关的因子。本研究探讨CCL17对人鼻咽癌肝细胞转移分化能力的影响。

1 材料和方法

1.1对象 2015年1月至2016年1月20例青海大学附属医院鼻咽癌手术切除所得的鼻咽癌组织，病例均经术后病理学检查证实为鼻咽癌，术前未经放化疗等相关抗肿瘤治疗，实验标本的利用均已获得患者本人或其委托人的知情同意。进行鼻咽癌组织细胞的培养传代及鼻咽癌干细胞的分选富集，获得20例鼻咽癌干细胞。其中男12例，女8例，年龄26～75岁，平均(54.66±5.78)岁，26～59岁6例，60～75岁14例。

1.2试剂和仪器 恒温箱(江苏佳美仪器有限公司)、流式细胞仪(德国Partec公司)、离心管、玻璃瓶、吸管、试管等(广东东普医疗科技有限公司)、改良杜氏伊格尔培养基(DMEM)/F12培养基和胎牛血清(美国Gibco公司)、RNA提取试剂盒(德国Qiagen公司)、逆转录试剂盒(美国Promega公司)、实时定量(RT)-聚合酶链反应(PCR)试剂盒和SYBR Premix EX Taq(日本Takara公司)、倒置相差显微镜、荧光显微镜(日本Nikon公司)、脂质体转染液 LipofectamineTM转化生长因子β1(美国Invitrogen 公司)、凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司)、碱性成纤维细胞生长因子(美国Invitrogen 公司)、泼尼松、胰岛素、β甘油磷酸钠、维生素C、3-异丁基-1-甲级黄嘌呤、吲哚美辛(美国Sigma 公司)、医用恒温水浴箱(美国SHELLAB公司)。

1.3细胞复苏 实验器具紫外线照射1 h后将需复苏的细胞迅速放入37℃水浴箱中，摇晃使固态细胞融化，1 200 r/min离心5 min，弃去上清液，加入1 ml细胞培养液，移入培养瓶中，补充细胞培养液至5 ml，轻晃使细胞均匀分布，将培养瓶置于37℃、5%CO2恒温箱中培养。

1.4细胞传代培养 细胞融合度达到80%以上时采用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗细胞3次，去除残留血清，加入0.25%的胰酶1 ml消化至细胞变小且细胞间隙变宽，弃去胰酶并加入15 ml的细胞培养液，混匀，均分于3个培养瓶中进行培养。将细胞再次进行消化离心，加入细胞冻存液1.5 ml移入冷冻管中，液氮保存。

1.5鼻咽癌干细胞得分选富集 癌细胞无血清悬浮培养至对数生长期,胰酶消化,制备成单细胞悬液，进行细胞计数，调整细胞密度，采用流式细胞仪分选p75NTR+细胞(鼻咽癌干细胞)。

1.6CCL17转染 将鼻咽癌肝细胞放入培养皿中并观察鼻咽癌干细胞，取生长状态良好的鼻咽癌干细胞铺于2个6孔板中，至细胞融合度达到80%左右时向其中一个6孔板各孔添加预先配置的脂质体Lipofectamine20005 μl和CCL17 3.75 μl无血清RPMI1640培养液各孔均添加2 ml，将化学合成的CCL17(序列为：5'-GGGACTGCTGCCTGGAGTAC-3')瞬时转染鼻咽癌干细胞轻轻晃匀后置入孵箱中进行孵育。2 d后提取总RNA，检测CCL17和血管内皮生长因子(VEGF)的mRNA表达相对强度和蛋白表达水平。

1.7抗CCL17抑制剂转染 将鼻咽癌肝细胞放入培养皿中并观察鼻咽癌干细胞，取生长状态良好的鼻咽癌干细胞铺于2个6孔板中，至细胞融合度达到80%左右时向其中一个6孔板各孔添加预先配置的脂质体Lipofectamine20005 μl和3.75 μl无血清RPMI1640培养液，采用化学合成的siRNAoligo，序列为：5'-ATGTTTTTGCTACCGTAGGGA-3'，2 d后提取总RNA，检测CCL17和VEGF的mRNA表达相对强度和蛋白表达水平。

1.8向成骨诱导分化 将鼻咽癌干细胞培养于含10%胎牛血清的培养基中，添加0.1 μmol/L的泼尼松、50 μmol/L的维生素C及10 mmol/L的β甘油磷酸钠，每3 d定期更换培养基，共培养21 d。分别于培养前和培养后提取总RNA，采用RT-PCR检测骨钙素等成骨标志物的mRNA表达水平。

1.9向软骨诱导分化 将鼻咽癌干细胞培养于含10%胎牛血清的培养基中，添加10 μg/L的转化生长因子、1 μg/L的碱性成纤维细胞生长因子及6.25 mg/L的胰岛素，每3 d定期更换培养基，共培养21 d。分别于培养前和培养后提取总RNA，采用RT-PCR检测Ⅱ型胶原等软骨标志物的mRNA表达水平。

1.10向脂肪诱导分化 将鼻咽癌干细胞培养于含10%胎牛血清的培养基中，培养至90%融合，添加1 μmol/L的泼尼松、0.5 mmol/L的3-异丁基-1-甲级黄嘌呤、2 μmol/L的胰岛素及200 mmol/L的吲哚美辛，每3 d定期更换培养基，共培养21 d。分别于培养前和培养后提取总RNA，采用RT-PCR检测脂联素等脂肪标志物的mRNA表达水平。

1.11Transwell小室法 常规水化基底膜，分别于转染前后2 d收集细胞，并调整细胞数为5×105/ml，向Transwell小室添加含10%胎牛血清的RPMI1640培养液900 μl和200 μl的细胞悬液，将细胞接种于Transwell小室，培养12 h后采用4%多聚甲醛进行为时0.5 h的固定，弃去固定液，采用0.1%结晶紫染色20 min，弃去染色液并采用PBS冲洗3次。倒置Transwell小室于显微镜下放大100倍，观察并进行细胞计数。

1.12划痕实验 划痕实验操作同参考文献〔7〕。

1.13RT-PCR检测转染前后及诱导分化前后各因子mRNA 相对表达量的检测 常规提取总RNA，采用TaqMan@ Small RNA Assays试剂盒进行逆转录反应，操作按照试剂盒说明进行，将cDNA冷藏于-20℃恒温箱中备用。实行RT-PCR检测，操作亦按照TaqMan@ Small RNA Assays试剂盒说明书进行，反应条件分别为先于50℃环境中反应2 min，再于95℃环境中反应10 min，再于95℃环境中反应15 s，最后于60℃环境中反应60 s，共进行40个循环。进行3次独立重复检测。采用7500SDS v1.3.1软件操作，以18 S rRNA为内参，所得数据采用2-ΔΔCt公式进行分析，其中Ct为各复孔平均值，ΔCt=Ct目标-CtU6，ΔΔCt=ΔCt处理组-ΔCt未处理组。

1.14统计学分析 采用SPSS19.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1CCL17转染前后CCL17和VEGF mRNA相对表达量的比较 人工合成的CCL17瞬时转染后，鼻咽癌干细胞中CCL17和VEGF mRNA表达相对强度较转染前明显升高(P<0.001)，见表1。

表1 CCL17转染前后CCL17和VEGF mRNA相对表达量的比较

2.2CCL17转染前后鼻咽癌干细胞侵袭及迁移能力比较 人工合成的CCL17瞬时转染后，鼻咽癌干细胞侵袭及迁移能力〔Transwell穿膜细胞数(146.65±21.75)〕较转染前(65.58±6.68)明显升高(t=15.880，P=0.000)。

2.3CCL17转染对分化诱导的骨钙素、Ⅱ型胶原和脂联素mRNA表达相对强度的影响 人工合成的CCL17瞬时转染后，鼻咽癌干细胞骨钙素、Ⅱ型胶原和脂联素mRNA表达相对强度转移降低(P<0.001)，见表2。

表2 CCL17转染对分化诱导的骨钙素、Ⅱ型胶原和脂联素mRNA表达相对强度的影响

2.4人工合成的抗CCL17抑制剂瞬时转染前后CCL17和VEGF mRNA相对表达量的比较 人工合成的抗CCL17抑制剂瞬时转染后，鼻咽癌干细胞中CCL17和VEGF mRNA表达相对强度较转染前明显降低(P<0.001)，见表3。

2.5人工合成的抗CCL17抑制剂瞬时转染前后鼻咽癌干细胞侵袭及迁移能力 人工合成的抗CCL17抑制剂瞬时转染后，鼻咽癌干细胞侵袭及迁移能力〔Transwell穿膜细胞数(11.16±4.54)〕较转染前(65.86±6.68)明显降低(t=30.288，P=0.000)。

2.6人工合成的抗CCL17抑制剂瞬时转染对分化诱导的骨钙素、Ⅱ型胶原和脂联素mRNA表达相对强度的影响 人工合成的抗CCL17抑制剂瞬时转染后，鼻咽癌干细胞骨钙素、Ⅱ型胶原和脂联素mRNA表达相对强度较转染前明显升高(P<0.001)，见表4。

表3 人工合成的抗CCL17抑制剂瞬时转染前后CCL17和VEGF mRNA相对表达量的比较

表4 人工合成的抗CCL17抑制剂瞬时转染对分化诱导的骨钙素、Ⅱ型胶原和脂联素mRNA表达相对强度的影响

3 讨 论

鼻咽癌是最为常见的头颈部恶性肿瘤，其发病率近年来随着环境污染的加剧而呈现快速增长的趋势〔8〕。鼻咽癌恶性程度高，病情严重，极易发生淋巴结转移及肝肺等的远处转移，累及全身多处脏器，引发全身多处器官的病变，加重患者病情，最终造成死亡等不良预后情况的发生〔9～11〕。因此，对鼻咽癌进行有效的防治十分重要。鼻咽癌治疗的效果差，其治疗后复发率高，且常伴有远处转移，其治疗困难，疗效欠佳〔12,13〕。鼻咽癌的侵袭转移是影响其预后的重要因素之一〔14〕。抑制鼻咽癌侵袭转移可能有助于鼻咽癌治疗效果的提高和预后情况的改善。肿瘤的生长和侵袭转移均依赖其血管的生成，而VEGF是与肿瘤血管生成密切相关的因子，在肿瘤血管生成中具有重要作用，可促进肿瘤血管的形成而促进肿瘤生长和转移〔15～17〕。本研究结果亦发现，鼻咽癌干细胞中的VEGF表达水平高，可通过发挥其促进血管生成的作用而促进鼻咽癌的转移和发展。因此对VEGF表达进行抑制从而抑制肿瘤血管形成、肿瘤生长及肿瘤转移对抑制鼻咽癌等恶性肿瘤的转移和改善其疗效具有重要意义。肿瘤的分化程度与肿瘤的恶性程度密切相关〔18〕。高分化肿瘤的恶性程度低，常无转移，仅有部分可出现肿瘤的复发，而低分化肿瘤的恶性程度高，极易发生转移和复发〔19～21〕。本研究结果发现，鼻咽癌的分化程度较低，其恶性程度高，急需有效的干预。因此通过采取措施促进鼻咽癌分化亦可能是治疗鼻咽癌的有效方法。本研究结果表明，CCL17在鼻咽癌的发生发展中具有重要作用。因此，CCL17可能成为鼻咽癌治疗的靶基因之一。本研究结果提示CCL17可能通过调控VEGF促进鼻咽癌血管生成而提高鼻咽癌的侵袭转移能力，并抑制鼻咽癌的分化，是鼻咽癌的促癌因子。CCL17可能作为鼻咽癌治疗的靶基因，通过抑制CCL17的表达可能有助于抑制其肿瘤的生长和侵袭转移，促进其肿瘤分化，降低其肿瘤恶性程度，抑制鼻咽癌转移和复发的发生，达到良好的治疗效果，从而改善鼻咽癌预后情况。

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