EX16+10Y试剂盒检测新疆维吾尔族人群的效能

毕 钢 ，张 晨 ，董 研 ，焦海涛 ，董 雷 ，周怀谷

（1.上海市公安局物证鉴定中心 法医物证学现场应用技术公安部重点实验室 上海市现场物证重点实验室，上海 200083；2.无锡中德美联生物技术有限公司，江苏 无锡 214174；3.乌鲁木齐市公安局刑事科学技术研究所，新疆 乌鲁木齐 830063）

目前，法医物证DNA个体识别检验主要采用常染色体STR分型试剂盒，父系遗传检验主要采用Y染色体STR分型试剂盒。有些情况下，个体识别和父系遗传检验需同时进行，为解决两种试剂盒分别检验带来人力物力的浪费，以及物证量微带来的检验困难等难题，本课题组采用EX16+10Y试剂盒对4620份新疆维吾尔族男性个体血样同时检测15个常染色体STR基因座和10个Y染色体STR（Y-STR）基因座，评估EX16+10Y试剂盒的检测效能。

1 材料与方法

1.1 样本

保存在FTA卡上的男性血液样本4620份，样本为随机采集的新疆维吾尔族未知关系个体，血样贡献者均为志愿者，并签署知情同意书。

1.2 主要试剂及仪器

EX16+10Y试剂盒（无锡中德美联生物技术有限公司）。3130xl基因分析仪、9700型PCR仪（美国AB公司），DB-100A手动打孔仪（北京达博创新科技开发有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 样本准备

采用DB-100A手动打孔仪截取直径1.2mm FTA血样卡滤纸放入96孔板，直接采用EX16+10Y试剂盒进行PCR扩增。同时以9948A为阳性对照，以去离子水为阴性对照。

1.3.2 PCR扩增

1.3.2.1 STR基因座信息

EX16+10Y试剂盒中常染色体基因座包括：D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539、D19S433、TPOX、TH01、D2S1338、CSF1PO、vWA、D5S818、FGA、D8S1179、D21S11、D18S51；Y染色体基因座包括：DYS390、DYS391、DYS392、DYS393、DYS438、DYS456、DYS458、DYS635、DYS385a/b。

1.3.2.2 PCR扩增条件

总反应体积 25 μL，包括：反应混合物 10 μL，引物混合物 5 μL，热启动 Taq 酶 1 μL（5 U），1.2 mm 滤纸片，去离子水9 μL。其中反应混合物：Mg2+终浓度0.9 mg/L，dNTP终浓度 0.28 mmol/L，BSA 终浓度0.9 mg/L，Tris-HCl 10 mmol/L，KCl 50 mmol/L，四甲基氯化胺10mmol/L，NaN30.008%。

PCR反应程序：95℃ 2 min；94℃ 30 s，55℃1min，72℃ 1min，循环 33 次；70℃ 1h；4℃持续。

1.3.3 电泳分析

PCR产物用3130xl基因分析仪进行毛细管电泳，用GeneMapper®ID v3.2软件进行基因型分析。当分型图谱的峰值大于100RFU时，满足检验分析要求。

1.4 统计学处理

采用PowerMarker V3.25[1]计算常染色体STR基因座观察杂合度（Ho）、多态信息含量（PIC），采用Powerstate软件计算个体识别率（DP）、匹配概率（Pm）、三联体非父排除率（PEtrio）。对各基因座等位基因进行Hardy-Weinberg平衡分析。

Y-STR基因座等位基因频率采用直接计数法，基因多样性（GD）计算公式为：

式中，n为样本数，Pi为单倍型频率。

2 结 果

2.1 15个常染色体STR基因座分型结果

4620份血样全部获得清晰的分型图谱，峰值大于100RFU，满足检验要求。等位基因的碱基数与Ladder相应等位基因的碱基数偏差介于±0.5 bp。阳性参照物9948的分型结果正确，均衡性好，阴性参照物无基因峰。

15个常染色体STR基因座的基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡（P〉0.05），Ho 为 0.637～0.838，PIC为 0.580～0.860，DP 为 0.811～0.978，累积个体识别率为0.99999999999999999。三联体累积非父排除率（CPE）达0.999998084，满足亲子鉴定需要。15个常染色体STR基因座的群体遗传学参数见表1。

表1 15个常染色体STR基因座的群体遗传学参数（n=4620）

2.2 10个Y-STR基因座的遗传多态性

10个Y-STR基因座在4620份新疆维吾尔族男性个体中共观察到766种单倍型，具有8个、9个、10个相同单倍型的分别为20、10、2人。DYS391的GD值最低（0.4537），DYS385a/b 的GD 值最高（0.9232）。YSTR基因座的等位基因频率分布和GD值见表2～3。

表2 新疆维吾尔族人群10个Y-STR基因座的等位基因频率 （n=4620）

表3 新疆维吾尔族人群10个Y-STR基因座的GD值（n=4620）

3 讨 论

STR基因座分型是目前主要的法医检验方法，探索如何增强STR基因座分型检验效能有实际意义。一般常染色体STR复合扩增用于个体识别，Y-STR复合扩增用于家系排查，这样分别检验，能满足部分工作的需要，如仅需要个体识别的案件或前科人员库的建立。在某些案件中，需要同时进行个体识别或家系排查，若将常染色体STR和Y-STR基因座同时扩增，能提高检材利用率，缩短检验时间，为案件快速侦破提供帮助。

EX16+10Y试剂盒中15个常染色体STR基因座和AmpFℓSTRTMIdentifilerTMPlus PCR扩增试剂盒（美国AB公司）中基因座完全相同，和DNA联合索引系统（CODIS）结合方便，便于实验室数据比对和共享。15 个常染色体 STR 基因座的 DP〉0.8、Ho〉0.7（除 TPOX外），联合应用可用于同一认定。PE值高，满足三联体亲子鉴定要求。相关研究董研等[2-3]已有报道。

EX16+16Y试剂盒中10个Y-STR基因座选择了AmpFℓSTRTMYfilerTMPCR扩增试剂盒（美国AB公司）中多态性较高的基因座。本研究中所有男性样本在Y-STR基因座均只检出1个等位基因。多态性分析发现，DYS391的GD值最低，为0.4537，DYS385a/b的GD值最高，为0.9232。与周卫江等[4]用AmpFℓSTRTMYfilerTMPCR扩增试剂盒对288名新疆维吾尔族群体的多态性研究进行了数据比对，GD值经t检验，差异无统计学意义。

为验证检验结果，我们对调查样本进行了实地调查，10个Y-STR基因座不相同者无血缘关系。结果表明，EX16+10Y试剂盒能满足大批量排查工作。但也有部分10个Y-STR基因座分型相同者，并未显示有血缘关系，对于这种情况，可通过增加Y-STR基因座检测进一步确认他们是否为同一家族。后期我们将开发EX16+16Y试剂盒，以提高排查的准确性。

[1]刘亚举，张俊涛.几款遗传学分析软件在法医生物统计中的应用[J].河南科技大学学报（医学版），2014，32（1）：62-64.

[2]董研，林双双，曹禹，等.15个常染色体和10个Y-STR基因座复合扩增试剂盒的研发[J].法医学杂志，2015，31（5）：373-376，380.

[3]ZHOU H，BI G，ZHANG C，et al.Developmental validation of forensic DNA-STR kits：Expressmarker 16+10Y and expressmarker 16+18Y[J].Forensic Sci Int Genet，2016，24：1-17.

[4]周卫江，李平.新疆维吾尔族群体16个Y-STR基因座遗传多态性[J].中国法医学杂志，2011，26（1）：61-62.