基于28S rRNA基因序列对洛阳地区嗜尸性蝇类的分子鉴定

赵琳琳 ，翟仙敦 ，张 振 ，吕 宙 ，夏志远 ，莫耀南

（1.河南科技大学法医学院，河南 洛阳 471003；2.西南政法大学刑事侦查学院，重庆 400031）

法医昆虫学（forensic entomology）是应用昆虫学及其他自然科学的理论与技术，对死亡时间（postmortem interval，PMI）和死亡地点进行推断，从而解决司法实践中有关昆虫问题的一门科学。研究[1-4]表明，与尸体腐败联系最紧密的是双翅目与鞘翅目昆虫，但鞘翅目昆虫到达尸体时间较晚，而双翅目昆虫常常第一时间到达尸体，具有更重要的法医学意义，尤其是双翅目中的丽蝇科、麻蝇科与蝇科。传统的形态学鉴定要求鉴定人具有丰富的经验，在我国仅有少数形态学专家具备这方面的能力。鉴于案发现场蝇类的多样性和复杂性，非昆虫专业人员很难依据其形态鉴定种属，因此寻找一种简单、准确、迅速、通用的方法是当务之急。近年来国内外关于昆虫的分子鉴定为嗜尸性蝇类的种属鉴定开辟了新途径，其中最常用的是线粒体基因组 COⅠ、COⅡ、16S rRNA 等基因序列[5-6]，核基因组28S rRNA基因序列也逐渐被国外学者研究并证实可以进行嗜尸性蝇类的种属鉴定[2，7]。本研究拟对嗜尸性蝇类核基因组变异性较大的28S rRNA基因中715bp序列片段进行分析，进而对洛阳地区常见嗜尸性蝇类进行种属鉴定，以方便法医昆虫学的应用。

1 材料与方法

1.1 样本

1.1.1 蝇类样本采集

放置大鼠尸体于河南科技大学（洛阳）操场树荫下诱捕蝇类，之后用离心管分类单独密封包装置于-20℃冰箱中保存。依据《中国常见蝇类检索表》进行形态学种类鉴定，共捕捉到8只丝光绿蝇Lucilia sericata（Meigen，1826）、1 只 铜 绿 蝇 Lucilia cuprina（Wiedemann，1830）、11 只大头金蝇 Chrysomya megacephala（Fabricius，1794）、2 只 家 蝇 Musca domestica （Linnaeus，1758）、4 只棕尾别麻蝇 Sarcophaga peregrina（Robineau-Desvoidy，1830）、3 只 肥 须 亚 麻 蝇 Sarcophaga crassipalpis（Macquart，1839）。

1.1.2 虚拟样本来源

虚拟样本来自GenBank数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）和 EMBL 数据库（https://www.ebi.ac.uk/），在数据库中以6种蝇类［丝光绿蝇Lucilia sericata（Meigen，1826）、铜绿蝇 Lucilia cuprina（Wiedemann，1830）、大头金蝇 Chrysomya megacephala（Fabricius，1794）、家蝇 Musca domestica（Linnaeus，1758）、棕尾别麻蝇 Sarcophaga peregrina（Robineau-Desvoidy，1830）、肥须亚麻蝇 Sarcophaga crassipalpis（Macquart，1839）］和28S rRNA为关键词进行索引，将大于700bp的序列纳入本研究。经筛选共得到28条其他地区的记录，其中2条为家蝇，详见表1。

表1 GenBank和EMBL检索数据汇总情况

1.2 方法

1.2.1 DNA提取

每个样本取腿4条，清洗，捣碎，用Chelex-100法提取腿部DNA，置于-20℃保存备用。

1.2.2 PCR扩增

采用TaKaRa Ex Taq®试剂盒［宝日医生物技术（北京）有限公司］对28S rRNA基因中的目的片段进行扩增。扩增引物为：上游引物5′-GACTACCCCCTG AATTTAAGCAT-3′；下游引物 5′-GACTCCTTGGTCC GTGTTTCAAG-3′。 扩增总体系为 50 μL，包括 10×PCR 缓冲液（含 Mg2+） 5μL，dNTP 混合物（2.5mmol/L）6 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各 2 μL，5 U/μL 的 Ex Taq®DNA 聚合酶 0.75μL，DNA 模板 6μL，ddH2O 补足。PCR循环参数：94℃预变性1 min；94℃ 1 min，45℃ 1.5 min，72℃ 1.5 min，5 个循环；94℃ 1 min，50℃ 1.5min，72℃ 1min，35 个循环；72℃延伸 8min。扩增产物于4℃保存。

1.2.3 电泳检测及测序分析

PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳（120V 30min），溴化乙锭染色，置于凝胶成像系统拍照分析。

测序引物为PCR扩增引物，扩增产物由上海立菲生物技术有限公司测序，正反向双向测序以保证序列的准确性。应用MEGA7.0[8]分析软件将所测29个样本的基因序列进行整理，在BLAST搜索（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）进行序列比对。纳入来自GenBank和EMBL数据库的28条相应蝇种序列，以家蝇为外群，经MEGA7.0分析软件比对，剪切为相同长度，然后按邻近法（neighbor-joining，NJ）对序列进行碱基组成、进化分歧率和系统发育树分析，Bootstrap值为1000。

2 结 果

2.1 DNA提取及测序结果

本研究共获得3科5属6种29个样本的DNA，DNA提取效果较好，部分样本DNA扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果见图1。与来自GenBank和EMBL数据库的28个蝇种（含2只家蝇）序列合并分析，获得片段长度为715bp。

图1 部分样本DNA扩增后电泳图谱

2.2 BLAST比对结果

BLAST比对结果（表2）显示所得样本DNA与GenBank中已知序列一致（相似度均为100%），与形态学鉴定结果相符合。但并未发现与样本23、24、25和26一致的基因序列，形态学鉴定该4个样本为棕尾别麻蝇，GenBank中搜索棕尾别麻蝇Sarcophaga peregrina的28S rRNA基因序列，共有4条记录，但显示长度均约400bp。

表2 29个样本28S rRNA基因中715bp序列在线BLAST比对结果

表2（续）

2.3 碱基组成分析

家蝇作为外群除外，对所得53个样本的基因序列进行碱基组成分析，结果显示：保守位点677个，可变位点37个，其中简约性信息位点36个，自裔位点1个。碱基平均组成：T=34.3%，C=13.2%，A=34.2%，G=18.3%，A+T=68.5%，具有明显的A+T倾向性。

2.4 系统发育树分析

以家蝇为外群，运用MEGA7.0软件对其他53个样本基因序列进行分析，构建系统发育树，结果按照不同科、属、种分别聚类，分子鉴定结果和形态学鉴定结果一致（图2）。53个样本自上而下分别形成2个群聚，分别代表丽蝇科和麻蝇科。丽蝇科又分为2支，分别代表绿蝇属和金蝇属，属间Bootstrap检验可信度为81%。绿蝇属包括17只丝光绿蝇和14只铜绿蝇，两个蝇种分别聚类，两者的种内Bootstrap检验可信度分别为98%和96%，种间Bootstrap检验可信度为100%；金蝇属包括14只大头金蝇，种内Bootstrap检验可信度为99%。麻蝇科分出亚麻蝇属和别麻蝇属2支，属间Bootstrap检验可信度为94%。亚麻蝇属包括4只肥须亚麻蝇，种内Bootstrap检验可信度为82%；别麻蝇属包括4只棕尾别麻蝇，种内Bootstrap检验可信度为97%。各个科、属、种间的划分清晰，效果好。

2.5 种内及种间进化分歧

经过对不同地区2科4属5种53个蝇类个体的遗传距离进行计算，获得不同蝇种种间差异为0.007～0.045，种内差异为0～0.001，种间差异和种内差异没有交叉（表3）。

图2 基于53个样本28S rRNA基因中715bp序列构建的系统发育树

表3 53个样本28S rRNA基因中715bp序列的种间差异和种内差异

3 讨 论

根据尸体上嗜尸性蝇类生态群落演替规律对死亡时间和死亡地点进行推断，首要任务就是鉴定其种类。尽管我国具有丰富经验的昆虫学专家能够快速、精确地作出鉴定，但也仅限于成虫，困难的是对蝇类卵、幼虫、蛹生长发育规律的把握和形态学的鉴定，这对于缺乏昆虫学专业知识的广大法医工作者来说更是难上加难，因此寻找一种简单、准确、迅速、通用的方法是当务之急。1994年SPERLING等[9]首次将一种以DNA为基础的方法用于嗜尸性昆虫种类鉴定，此后DNA分子鉴定作为形态学鉴定方法的补充手段被越来越多的法医昆虫学研究者所接受。

28S rRNA基因是真核生物染色体上编码核糖体大亚基的基因，具有重要的生物学功能，在进化上比较保守，是研究生物系统发育较好的分子标记。其序列中包含12个可变区，基因变异性较大，因此可用于嗜尸性蝇类从科到种水平上的分子鉴定。YUSSEFFVANEGAS等[2，7]应用28S rRNA基因序列成功对丽蝇科属种进行鉴定，本研究结果与其一致。葛振萍等[10]用28S rRNA基因中698 bp序列片段作为分子标记对常见有瓣蝇类的系统发育关系进行研究，取得了很好的效果。

本研究中，分子鉴定结果与形态鉴定结果一致。洛阳地区的5种嗜尸性蝇类27条序列与来自GenBank和EMBL数据库不同国家不同地区的26个相应蝇种序列（表1）合并分析后发现，利用细胞核28S rRNA基因中715bp的基因序列可以有效地将洛阳地区常见嗜尸性蝇类鉴定到种的水平。BLAST在线比对过程中没有发现与棕尾别麻蝇一致的该基因序列，检索GenBank棕尾别麻蝇28S rRNA序列，只发现4条长度约400bp的短序列，说明该蝇种的相关研究较少，而本研究的序列信息可以为此提供补充。构建的系统发育树显示，丝光绿蝇与铜绿蝇分成明显的两支，可初步认为该基因序列能够对亲缘关系非常近的丝光绿蝇与铜绿蝇进行鉴别，这与WILLIAMS等[7，11]的研究结果一致。

根据WELLS等[12]的研究表明，判定一个遗传标记是否能够进行嗜尸性蝇类的分子鉴定，起决定作用的是种内序列变异的百分比，且与种间序列变异百分比无重叠。联合线粒体基因COⅠ和COⅡ进行鉴定，种内差异〈1%，种间差异≥3%，通过分子鉴定，即使不能够准确确定某一特定嗜尸性蝇种，至少可以把未知蝇种定位于某一特定的进化分支上。本研究中，不同蝇种种间差异为0.007～0.045，种内差异为0～0.001，与WELLS等的研究相比，种间差异未达到3%，但种间差异和种内差异没有交叉，所有样本均位于某一特定的分支上，并且Bootstrap检验可信度≥81%。与国内研究[13-14]也有一些差异，这可能与样本量大小、所捕获的蝇种差异及分子标记的选择有关。鉴于本研究中两种麻蝇的种间差异只有0.007，本实验又选择了COⅠ基因序列中经典DNA条形码序列采用相同的实验和分析方法再次验证，结果发现两者的种间差异为0.080，初步推测本研究中所选择的28S rRNA基因序列对麻蝇的鉴别能力有限，这有待于增加样本种类和数量进一步研究。

本研究中采用蝇类样本腿部提取DNA，简便易行，同时Chelex-100法是法医实验室的常规方法，更有利于在基层实验室的推广。尽管28S rRNA靶基因序列片段相对较长，但对于目前的技术，一个测序反应足以完成。鉴于28S rRNA基因变异性大的特点，其对嗜尸性蝇类鉴定有独特优势，本课题组将在此基础上进一步筛选高变异的短片段用于嗜尸性蝇类分子鉴定的研究。

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