应用琼脂糖微球抗体筛选原代乳鼠肺微血管内皮细胞新方法的建立

刘姗，刘艳霞，闫承慧，田孝祥，刘丹，刘美丽，张坡，韩雅玲

血管内皮细胞覆盖于血管内膜表面，是研究血管生物学的常用模型。血管内皮细胞不仅是血液与血管之间的机械屏障，还分泌缩血管因子和舒血管因子与自身细胞受体结合，在血管通透性、炎症反应、血管生长等方面发挥重要作用[1-3]。微血管内皮细胞是研究血管生长、通透性等的重要模型[4-6]。本研究采用琼脂糖微球抗体筛选法，建立了一种简便、高效的分离肺微血管内皮细胞(pulmonary microvascular endothelial cells，PMVECs)的方法，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 小于1周龄的清洁级健康C57BL/6乳鼠(购自辽宁长生生物有限公司)，实验动物许可证号：SCXK(辽)2015-0001。

1.2 主要试剂与仪器 蛋白A/G琼脂糖微球、Hanks液、胶原酶Ⅰ(美国Thermo Scientific公司)，大鼠抗小鼠CD31抗体(美国BD Pharmingen公司)，BSA牛血清白蛋白、CCK-8(中国Beyotime公司)，异氟烷(中国河北一品制药股份有限公司)，内皮细胞培养基、胎牛血清、抗生素、生长因子(美国Sciencell公司)，胰蛋白酶(中国上海生工公司)，明胶(美国Sigma公司)，基质胶(美国Corning公司)，山羊抗CD31抗体、兔抗血管性血友病因子(vWF)抗体、Cy3山羊抗兔荧光二抗、Cy3驴抗山羊荧光二抗、DAPI、抗荧光淬灭封片剂(中国谷歌生物公司)，常温离心机(英国Grant-Bio公司)，低温离心机、酶标仪(德国Eppendorf公司)，旋转混合仪(中国宁波新芝公司)，倒置相差显微镜、共聚焦显微镜(日本Olympus公司)，CO2培养箱(德国Heraeus公司)。

1.3 乳鼠PMVECs的分离与培养

1.3.1 制备CD31抗体琼脂糖微球 在超净台内，取无菌EP管，将20μl琼脂糖微球加入400μl 0.1%BSA溶液中，将EP管置于旋转混合仪上旋转1min；静止5min后吸除上清，用0.1% BSA重悬，置于旋转混合仪旋转。该操作重复3次，尽量去除琼脂糖微球溶液中对细胞有害的叠氮化钠。上述EP管中加入10μl的CD31抗体，制备成CD31抗体琼脂糖微球，置于旋转混合仪上旋转混合，于4℃冰箱内孵育过夜。

1.3.2 原代PMVECs的培养 将乳鼠用异氟烷麻醉后，以75%乙醇浸泡处死。在超净台内解剖乳鼠，用无菌生理盐水冲洗肺脏，尽量去除血细胞，取肺脏边缘组织置于含有Hanks液的100mm培养皿中。然后用无菌剪刀尽量将肺脏剪碎约1min。先将25ml的0.2%胶原酶置入50ml离心管中，在37℃水浴箱中预热。再将剪好的肺脏放入预热的胶原酶中，在37℃、200r/min的摇床内孵育45min。用无菌的玻璃研磨器研磨肺组织悬液，小心避免起泡沫。将研磨后的肺组织放入无菌的15ml离心管中，4℃、1300r/min离心8min，吸尽上清及未研碎的组织，剩下细胞沉淀。用1ml的0.1%冰BSA溶液重悬细胞，4℃、1300r/min离心8min，吸尽上清，剩下的沉淀为肺内混合细胞(本步骤重复3次)。用1ml的PBS溶液重悬细胞，吸至新的1.5ml无菌EP管中，再加入50μl CD31抗体琼脂糖微球，将EP管置于旋转混合仪中，室温旋转混合10min，使PMVECs特异性地与CD31抗体琼脂糖微球结合。1000r/min离心2min后，混合液分3层，吸尽上清及下层未与微球结合的细胞，留取中层微球至新的EP管中。用1ml的内皮细胞培养基重悬微球细胞，尽量使细胞与微球分离，将混合液加入含1ml内皮细胞培养基的6孔板(0.1%明胶包被)中。PMVECs的分离示意图见图1。

图1 PMVECs分离示意图Fig.1 Sketch of isolating PMVECs

1.3.3 传代培养 细胞贴壁后，用PBS洗3次，更换新鲜的内皮细胞培养基，去除残留的微球。当内皮细胞融合达到80%时，吸尽培养基，PBS洗3次，加入0.25%胰酶消化3min，加入内皮细胞培养基及时终止消化。1000r/min离心5min，用内皮细胞培养基重悬细胞，按照1:2比例传代至6孔板内。

1.4 形态学观察 用倒置显微镜观察细胞生长状态和形态学变化。将倒置显微镜调至100倍放大倍数，观察单个细胞形态及整体细胞生长情况并拍照。

1.5 细胞鉴定

1.5.1 免疫荧光染色 用免疫荧光染色法分别检测CD31、vWF的表达。用第2代细胞制备细胞爬片。4%多聚甲醛固定15min，PBS洗3次，0.2% Triton X-100穿膜通透15min，PBS洗3次，5%山羊血清封闭，室温孵育30min。加入CD31抗体(1:100)100μl，4℃冰箱内孵育过夜。PBS洗3次，加入Cy3驴抗山羊荧光二抗(1:100)100μl，室温避光孵育1h。PBS洗3次。DAPI(1:1000)100μl染细胞核30s。最后用抗荧光淬灭封片剂封片，荧光显微镜观察、拍照。vWF免疫荧光染色方法同上，采用Cy3山羊抗兔荧光二抗。两种抗体免疫荧光染色各随机选取5个视野，重复3次，分别计算PMVECs阳性率。PMVECs阳性率=(阳性细胞数/细胞总数)×100%

1.5.2 PMVECs体外血管形成实验 实验前1d将基质胶放在冰上，置于4℃冰箱过夜融化。用预冷的枪头取出基质胶，在24孔板上每孔加入289μl基质胶。将24孔板置于37℃培养箱内孵育30min，使基质胶凝固。轻轻滴加PMVECs细胞悬液300μl(105个细胞)。采用倒置显微镜每隔2h观察1次PMVECs的体外血管形成情况。

1.6 CCK8法绘制PMVECs生长曲线 取第2代PMVECs以每孔5000个细胞接种在96孔板上。实验分为对照组和PMVECs组，每组设3个复孔。在细胞贴壁后，吸出原培养基，加入10μl CCK-8溶液和新鲜内皮细胞培养基90μl，在37℃培养箱内孵育2h，检测450nm波长处的吸光度(OD)值。同法连续测7d。绘制PMVECs的生长曲线。

2 结 果

2.1 PMVECs的形态学观察结果 PMVECs贴壁24h后，倒置显微镜下可见细胞呈短梭形、类圆形贴壁生长(图2A)；PMVECs贴壁72h后，可见细胞单层融合呈典型铺路石样排列(图2B)。

2.2 细胞鉴定

2.2.1 细胞免疫荧光染色 山羊抗CD31抗体免疫荧光染色后，胞质呈红色荧光，DAPI染细胞核呈蓝色荧光(图3A)。兔抗vWF抗体免疫荧光染色后，胞质呈红色荧光，DAPI染细胞核呈蓝色荧光(图3B)。两种内皮细胞特异性抗体CD31、vWF均表达阳性，证实培养的细胞为PMVECs。通过随机选取5个视野，重复3次，CD31染色PMVECs阳性率为91.35%±3.06%，vWF染色PMVECs阳性率为92.99%±2.67%。

2.2.2 PMVECs体外血管形成实验 PMVECs接种至基质胶，每隔2h观察1次，发现在接种8h后，已完整形成血管网状结构(图4)。

图2 倒置显微镜下观察的细胞形态学结果(×100)Fig.2 Morphology of PMVECs (Inverted microscope ×100)

图3 免疫荧光染色结果(×100)Fig.3 Immunofluorescence staining of PMVECs (×100)

图4 PMVECs接种8h后基质胶上形成的血管管状结构(×40)Fig.4 Vascular tubular structure formed on matrigel 8h after inoculation of PMVECs (×40)

2.3 CCK8法绘制生长曲线 PMVECs接种后前2d，细胞贴壁生长，细胞增殖较为缓慢。接种后2～5d，细胞处于对数期生长。接种后7d，细胞增殖减慢，甚至出现凋亡现象(图5)。

图5 CCK8法绘制的生长曲线Fig.5 Growth curve drawn by CCK8 method

3 讨 论

获取微血管内皮细胞的常用方法有组织块贴壁法[7]、酶消化法[8]、免疫磁珠法[9]。通过组织块贴壁法获得的PMVECs培养时间长，首次传代时间为13.0±0.7d。通过酶消化法获得的PMVECs阳性率(61.05%±7.38%)不高[10]。通过免疫磁珠法获得的PMVECs虽然细胞纯度较高，但操作需有特殊仪器，且试剂比较昂贵。本研究采用的CD31抗体琼脂糖微球法是通过抗原抗体结合的方式筛选出PMVECs，具有培养时间短、阳性率高、操作简便等优势，首次传代时间少于4d，PMVECs阳性率超过90%。

蛋白A/G琼脂糖微球是将蛋白A/G共价耦联在固体载体琼脂糖微球上，常用于免疫沉淀或免疫共沉淀实验，对蛋白功能进行研究。CD31被称为血小板内皮细胞黏附分子，主要表达于内皮细胞、血小板、巨噬细胞，被认为是一种不成熟和成熟的血管内皮细胞标记物[11]。CD31的同种型是IgG2a，与蛋白A/G的结合属于强结合[12]。蛋白A/G琼脂糖微球和CD31抗体预先孵育，使微球能够特异性吸附抗原，而PMVECs细胞表面存在与CD31抗体结合的特异性抗原，这样就可以通过琼脂糖微球将PMVECs吸附分离出来。本方法重复多次，均可成功分离、培养出PMVECs。

在本实验的PMVECs培养过程中需要注意以下5个方面：①选用1周内的乳鼠，其细胞增殖能力强，可缩短细胞培养周期。细胞在3代以内生长快且形态稳定，可用于实验研究。②采用0.1%明胶包被6孔板，有利于细胞的贴壁生长。分离培养过程中，有时混杂少量成纤维细胞，采用内皮细胞专用培养基、内皮细胞生长因子，可抑制成纤维细胞的生长。另外，采用差速消化法，传代过程中胰酶消化3min及时终止消化，此时大多数内皮细胞被消化下来，而成纤维细胞仍旧贴壁。③选用胶原酶Ⅰ，能温和地将研磨后的肺组织消化成单个细胞，优于其他消化酶。④CD31表达于内皮细胞表面，其免疫荧光染色阳性是内皮细胞的经典鉴定方式。vWF仅在内皮细胞、血小板、巨核细胞和合体滋养细胞中表达，在内皮细胞中存储于杆状Weibel-Palade小体中，可产生核周染色[13]。⑤基质胶是从Engelbreth-Holm-Swarm小鼠肉瘤(富含细胞外基质蛋白)中提取的，其主要成分是层粘连蛋白，其次是Ⅳ型胶原、硫酸乙酰肝素蛋白多糖等。实验证明内皮细胞借助基质胶可形成血管管状结构[14]。

综上，本实验室采用琼脂糖微球抗体筛选法分离、培养乳鼠原代PMVECs，方法简便、高效，是一种值得推广的分离培养乳鼠PMVECs的新方法，为血管功能研究等提供了参考。

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