核酸杂交检测在细菌性阴道病及外阴阴道假丝酵母菌病诊断中的应用价值

李田 李小毛 丁杰 黄敏 禹夜

中山大学附属第三医院（广州 510630）

阴道炎是妇产科常见病之一，最常见的是细菌性阴道病（bacterial vaginosis，BV）和外阴阴道假丝酵母菌病（vulvovaginal candidiasis，VVC）。两种疾病的发生均与阴道微生态平衡破坏相关。细菌性阴道病时，阴道内的乳酸杆菌减少，导致其他微生物大量繁殖，主要有加德纳菌、厌氧菌（动弯杆菌、普雷沃菌、紫单胞菌、类杆菌、消化链球菌等）以及人型支原体，其中以厌氧菌居多［1-2］。Nugent评分法诊断细菌性阴道病在灵敏性、特异性、客观性及可重复性方面均相对较好，但因革兰染色自身技术的局限性，对工作人员自身素质要求高，使其在临床应用受限。Amsel法是临床常用检查方法之一，但由于主观因素强、需要人为的工作较多，越来越多的医生开始使用快速诊断试剂，例如BV蓝试剂，主要通过酶法间接诊断。外阴阴道假丝酵母菌病是第二种常见的阴道炎，真菌涂片镜检和真菌培养法是真菌学检验的基本方法，由于真菌培养可提高病原体的检出率、鉴定菌种和进行药敏试验，故其目前仍是诊断真菌感染的“金标准”［3］。但培养法耗时，不宜做为门诊常规检查。近年来分子诊断广泛应用，与传统检测比较，分子诊断在阴道炎诊断中的优势明显［4］。AffirmTMVPIII是一种通过DNA探针技术，以核酸杂交原理为基础，对临床具有阴道炎或阴道病症状患者的分泌物进行检测和识别阴道加德纳菌属，念珠菌属和滴虫的核酸的试剂。该检测方法于2015年美国CDC［3］推荐使用，但国内应用少，本文将传统的阴道炎检测方法与之比较，探讨其临床应用价值。

1 对象与方法

1.1 研究对象选取2017年8月中山大学附属第三医院妇科门诊具有阴道炎症状或体征的女性患者共103例。所有患者检测时均排除月经、妊娠、24 h内有性生活，72 h内有阴道冲洗以及1周内受过抗真菌、抗加德纳菌、抗滴虫的治疗。

1.2 标本采集在样本采集试管上贴上患者识别信息标签，标注样本采集时间。以盆腔检查体位安置患者，插入阴道窥器，以便能够看到阴道后穹窿。使用无菌棉签从阴道后穹窿采集标本，将棉签在阴道壁上转动或滚动2～3次，确保棉签的整个外周都已经接触过阴道壁。对于每个测试者，共使用4根无菌拭子分别从每位患者阴道后穹隆左右两侧取样。第1个取样拭子放入Affirm样本收集管中，室温下保存1 h之内进行测试。样本管加入裂解溶液之后，85℃裂解10 min，再加入缓冲溶液。将处理好的样本溶液转移入反应槽中，再在相应的孔位中加上底物溶液和探针分析卡（PAC），反应槽装入仪器进行自动运行。检测完成把PAC从仪器上取下进行结果判读。第2个取样拭子存放在无菌试管中，加入稀释液，然后把该拭子滚动涂布于2张玻片，一张用于用于线索细胞、真菌孢子和假菌丝的观察，一张用于Nugent评分。第3个取样拭子进行BV蓝试剂检测。第4个取样拭子行真菌显色培养。

1.3 检测方法

1.3.1 AffirmTMVPIII（由 Becton，Dickinson and Company提供）分析卡PACs阴性对照为无色，阳性对照为蓝色，则3种微生物的微球上显示蓝色为阳性，无色为阴性。

1.3.2 生理盐水涂片由固定的高年资检验师进行检查，显微镜下观察线索细胞、真菌孢子和假菌丝，以及滴虫。

1.3.3 Nugent评分使用珠海贝索生物技术有限公司的快速革兰氏染色液（Rapid Gram Stain），检验方法：标本薄而均匀地涂在玻片上，加龙胆紫液染色10 s，之后水洗，甩干；加碘溶液染色10 s，之后水洗，甩干；加脱色液脱色10～20 s，之后水洗，甩干；最后加沙黄溶液复染10s，之后水洗干燥。Nugent评分0～3分，为正常；4～6分，诊断中间型BV；≥7分，诊断BV。

1.3.4 BV蓝检测（爱必维试剂盒，由北京中生金域公司提供）把受试者的阴道分泌物置入试管内，在试管中滴入黄色稀释液6～18滴，在反应装置的5个孔内的每个孔中加入经处理过的样品1滴，当内容物超过反应孔的一半为最适宜位置，随后把“显色液A”滴入“唾液酸苷酶”反应孔内，大约1滴。把反应装置置入温度为37℃的水浴箱，显色后对其结果进行记录。

1.3.5 真菌培养采用真菌显色（真菌显色平板由江门市凯林贸易有限公司提供）培养法，把阴道分泌物标本接种于显色培养基上，25～28℃培养48 h后，有菌落生长为阳性，未培养出菌落为阴性。

1.4 统计学方法以Nungent评分和真菌培养法作为细菌性阴道病及外阴阴道假丝酵母菌病的诊断金标准，分别计算AffirmTMVPIII及常用检验方法（湿片镜检，BV蓝试剂）与金标准相对比较的敏感性及特异性。采用Kappa检验分别计算AffirmTMVPIII的检测结果与常用检验方法（湿片镜检，BV蓝试剂）的一致性。Kappa＞0，此时说明有意义，Kappa愈大，说明一致性愈好；Kappa≥0.75时，两者一致性较好，0.4≤Kappa＜0.75时，两者一致性一般；Kappa＜0.4时，两者一致性差。

2 结果

2.1 样本检测分布本次实验共采集103例有效标本评价AffirmTMVPIII检测方法的应用价值。入组人群中各种感染的比例（金标准方法）见表1、2，BV占48.5%，VVC占38.8%，其中混合感染总共有24例，占有效样本的23.3%。AffirmTMVPIII检测对混合感染的检出准确率为83.3%，湿片镜检的准确率为70.3%。

表1 不同检测方法的细菌性阴道病及外阴阴道假丝酵母菌病阳性率分布Tab.1 Distribution of positive rates of BV and VVC in different detection methods 例（%）

2.2 AffirmTMVPIII及常用检测方法与金标准方法对比针对细菌性阴道病，以Nugent评分结合临床症状为金标准，对比AffirmTMVPIII和湿片镜检、BV蓝试剂的检出一致性。AffirmTMVPIII检测的灵敏性、特异性和准确性最高，BV蓝试剂检测的准确性最低。见表3、4。

表2 入组人群各种感染的具体分布Tab.2 Specific distribution of various viginitis in the group

表3 细菌性阴道病各种诊断方法与金标准方法的对比Tab.3 Comparison of various diagnostic methods and gold standard methods of BV 例

表4 细菌性阴道病各种诊断方法与金标准方法对比的敏感性、特异性和准确性Tab.4 Sensitivity，specificity and accuracy of various diagnostic methods compared with gold standard methods of BV%

针对外阴阴道念珠菌病，以真菌培养结合临床症状为金标准，对比AffirmTMVPIII和湿片镜检的检出率（表5、6），Affirm与镜检方法的灵敏性、特异性和准确性均较高。所有的念珠菌感染中，白色念珠菌占92.1%，非白色念珠菌占7.9%。

表5 外阴阴道念珠菌病各种诊断方法与金标准方法的对比Tab.5 Comparison of various diagnostic methods and gold standard methods of VVC 例

表6 外阴阴道念珠菌病各种诊断方法与金标准方法对比的敏感性、特异性和准确性Tab.6 Sensitivity,specificity and accuracy of various diagnostic methods compared with gold standard methods of VVC %

3 讨论

本研究中门诊拟诊阴道炎的患者中，BV占48.5%，VVC占38.8%，其中混合感染总共有24例，占有效样本的23.3%，4例为滴虫性阴道炎与细菌性阴道病混合感染，细菌性阴道病的发生率最高，与国内外文献报道基本一致［5-6］。BV是以加德纳菌为主的一种混合感染，是阴道分泌物或恶臭的最普遍的原因。然而，调查显示，大多数BV患者无症状。研究［7-8］表明，BV可能是由大量具有促炎症特征的细菌引起的，宿主免疫功能异常所导致的免疫反应。合并BV的妇女其妇科术后并发症、妊娠合并症［9-10］风险增加，感染其他性传播疾病（STD）如人免疫缺陷病毒（HIV）、淋病奈瑟菌、沙眼衣原体和单纯疱疹病毒Ⅱ型（HSV-2）等风险增大［11］。提高BV的诊断水平，可使疾病得到及时的控制。对于BV的实验室诊断，本研究以Nugent评分法为金标准，AffirmTMVPIII检测的一致性最高，Kappa系数高达0.94，多项研究结果也显示AffirmTMVPIII的诊断更加客观和灵敏［12-13］，这一点也在本试验数据中得到了反映。2015年美国CDC［3］推荐AffirmTMVPIII可用于诊断BV。

AffirmTMVPIII核酸杂交法可准确识别有BV临床诊断意义的加德纳菌（浓度≥2×105CFU/mL阴道液）。BV蓝试剂是通过检测唾液酸苷酶活性来诊断BV，阴道微生态菌群中，普雷沃菌和拟杆菌是唾液酸苷酶活性增加的主要病原菌，部分加德纳菌有此酶活性，而动弯杆菌、消化球菌以及人型支原体的此酶活性基本不能检出。BV是多种厌氧细菌增多引起的，单纯依靠检测分泌物中唾液酸苷酶的活性，必然会导致漏检由唾液酸苷酶活性低的厌氧细菌增多引起的BV［14］。而AffirmTMVPIII可以检测出一定浓度的普雷沃菌、拟杆菌、动弯杆菌和支原体，漏诊的几率较单纯唾液酸苷酶检测小。

VVC是第二常见阴道感染性疾病，真菌培养法是金标准，但培养法耗时较长，不能快速获得培养结果。临床上湿片和涂片镜检是主要的检查方法。本研究以培养法为金标准，对比AffirmTMVPIII和湿片的检出率，两者与金标准比较的一致性都较好，Kappa系数分别为0.91和0.94。镜检方法容易受样本中干扰物质影响，观察者的经验以及细心检查很重要。本研究中的镜检由高年资检验师完成，与培养法比较，一致性高。AffirmTMVPIII可识别白色、光滑、热带、克柔、克菲、近平滑6种念珠菌，同样可以达到与培养法比较一致率高的检测水平，在大样本检测且人力不足的情况下可以替代镜检，检测客观敏感。

对于滴虫性阴道炎的诊断，本研究病例数不多，常用的湿片法检测敏感性低（51%～65%），在分子检测方法出现以前培养是金标准诊断方法，目前分子检测在滴虫的诊断中得到肯定，AffirmTMVPIII已被FDA批准用于滴虫性阴道炎的诊断［3］。

Affirm核酸杂交技术是DNA探针与目标RNA杂交，显色探针上连接的酶与底物反应，反应不需要扩增，环境里的极少量的核酸和微生物基本无干扰，病原体数量达到一定的（BV：2×105cfu；VVC：1×104cfu；TV：5×103cfu）显示阳性，避免了结果过于灵敏导致的误判。该检测技术一次取样可检测最常见的3种阴道炎症，全程自动化的处理和读取样本，摒弃了样本递送和显微镜观测的人为因素，确保诊断结果的全面、准确和稳定，本研究显示核酸杂交检测对混合感染的检出准确性明显高于镜检。

综上所述，AffirmTMVPIII核酸杂交检测在BV的诊断方面优势明显，在VVC诊断方面与湿片镜检相当，与真菌培养比较准确性高，虽然该检测成本较高，但其诊断快速、重复性高，对混合感染及疑难病例仍有较高的临床应用价值。

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