体外评价药物性肝损伤检测终点研究及其在检测系统中的应用

葛 帅，汤纳平，马 璟

（中国医药工业研究总院国家上海新药安全评价研究中心，上海 201203）

药物性肝损伤（drug-induced liver injury，DILI）在美国和欧洲是导致急性肝衰竭的第一大原因［1］。过去50年里，因肝毒性而导致新药研发终止或从市场撤回的事件时有发生，已成为制药企业和监管机构共同面临的挑战。努力改善临床前DILI预测、更好地将临床前检测结果转化为临床风险因素是亟待解决的重要问题。由于DILI发病机制的复杂性，单一的毒性检测终点对临床潜在毒性的预测相关性并不理想［2］。科学家们正在寻找敏感性和特异性更强的体外肝毒性检测终点，线粒体毒性、胆盐转运的抑制和反应性代谢物的形成已被证明是导致DILI的重要机制，其相关终点的检测正在成为体外DILI预测的补充实验［3］。包括细胞毒性在内的多参数细胞成像终点正被广泛研究［4］。免疫系统的激活通常是特异质DILI（idiosyncratic DILI，IDILI）反应的第一步，开发免疫相关的体外检测终点也是需要努力的重要方向。

近十几年来，随着荧光标记细胞成像技术在肝毒性评价中的应用，多终点检测取得了很大的技术进展，相关文章发表量呈暴发式增长。本文以“drug induced liver injury ANDin vitroAND eval⁃uation”为关键词，检索了PubMed数据库2007-2018年的文献。对检索到的241篇文献根据题目进行筛选，选取了其中与体外肝毒性检测相关的文献104篇。总结了现有的体外肝毒性检测终点的几种类型，包括常规的细胞毒性、线粒体毒性、胆汁淤积、代谢相关和免疫相关等终点，并参考了欧洲药物管理局网站的相关指导原则草案，最终汇总了当前体外DILI毒性终点的研究进展及其在检测系统中的应用，以期为药物潜在肝毒性的早期筛选和检测系统的合理选择提供参考。

1 常规细胞毒性检测终点

肝细胞损伤是DILI事件的主要细胞类型损伤，被假定为多个风险因素并发的启动事件。常规的细胞毒性试验依赖于检测化合物对一个或多个健康参数变化的影响，通常以简单的二维肝细胞系为模型，因实验系统具有简单、成本低、耗时短等优点，被制药公司作为一线筛选方法。

通常采用的评估终点包括细胞膜的完整性、细胞增殖力、细胞凋亡和氧化应激等，其中，ATP、活性氧（reactive oxygen species，ROS）和谷胱甘肽（glutathione，GSH）等常被用于肝损伤的检测指标。肝细胞特有的生物标志物如尿素、糖原和白蛋白等通常也被考虑在内（表1）。近几年，由于大量有关微RNA（micro RNA，miRNA）的基础研究能力提高，miRNA-122（miR-122）也开始列入肝细胞损伤的生物标志物［5］。这些检测终点是对细胞存活率或特定细胞器功能的粗略评估，一般无法提供对毒性机制的理解，通常认为无法反映特异性肝毒性［6］，但这些终点有助于鉴定毒性风险较大的化合物，这对于新药研发早期剔除具有不可接受毒性的候选化合物有很大价值。

表1 常规的细胞毒性检测终点

HepG2细胞和L-02细胞等肝细胞系被广泛用于常规细胞毒性检测，但其药物代谢酶，特别是Ⅱ相酶的表达水平较低，难以检出具有代谢活性的有毒化合物。人原代肝细胞保留了人特有的药物代谢酶和辅因子，一般被认为是用于肝毒性评价的“金标准”［11］。近年来，诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSC）分化的肝细胞和3D形式培养的肝细胞等新模型也广泛用于肝毒性筛选，大大提高了检测终点的敏感性。需要注意的是，基于不同的检测模型同一终点的检测结果可能有较大的差异，不同的检测终点在同一检测系统中可能对DILI有不同的敏感性和特异性，大多数研究者根据他们的具体实验的内部验证，对结果进行综合评估和判定。对这些检测终点建立明确的性能评估标准，将极大地提高化合物体外肝毒性筛选系统的准确性。

2 线粒体毒性检测终点

线粒体是细胞能量来源ATP合成的主要场所，其在能量需求较高的肝中含量更加丰富，使得肝对线粒体毒物更敏感。一方面，药物可通过抑制线粒体呼吸链酶复合物或解偶联电子传递，破坏线粒体呼吸作用，造成肝细胞能量供应不足，如噻唑烷二酮类药物［13］。另一方面，有些药物抑制长链脂肪酸的β-氧化，造成脂肪在肝细胞质的过度积累，如胺碘酮和哌克昔林等［14］。氧化还原类药物可能造成线粒体氧化应激，加速ROS的产生，如贝特类降血脂药物［15］。药物也可通过破坏线粒体DNA（mitochondria DNA，mtDNA），进而影响肝细胞线粒体功能，如非阿尿苷等核苷类似物［14］。

药物诱导的线粒体毒性检测终点包括结构改变和功能改变2种。反映结构改变的参数包括线粒体肿胀、线粒体超微结构的变化〔内膜和（或）外膜的完整性、嵴排列的变化及空泡化等〕，通常采用透射电镜观察。线粒体渗透性转换孔（mitochondrial permeablity transition pore，MPTP）的开放可反映线粒体膜的完整性，通过用钙黄绿素对线粒体染色能够判断MPTP的开放状态［15］。此外，线粒体是细胞内主要的钙离子（Ca2+）库，细胞内Ca2+能够反映线粒体结构的完整性。线粒体功能相关的参数大多能够实现定量检测，间接反映线粒体的健康状况。细胞内ATP含量和氧化应激参数如ROS是反映线粒体呼吸功能较为直观的终点。线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential，MMP）是线粒体内膜两侧质子和离子的不对称分布造成的，通常使用荧光染料如JC-1或四甲基若丹明（tetra⁃methylrhodamine methyl ester，TMRM）等对线粒体进行标记，检测MMP的变化［10，16］。能量代谢参数能够提供更多的机制信息，包括氧消耗率、细胞外酸化率、线粒体有氧代谢及糖酵解功能，可通过细胞能量代谢测定仪实现高通量检测［16］。具体的氧化磷酸化靶点可通过生物化学法或免疫捕获法检测化合物对单个线粒体蛋白复合物的作用［17］。对于抗病毒类药物，尤其是核苷类似物，应考虑其对mtDNA及聚合酶的影响，可通过对mtDNA或mtRNA的定量PCR检测，或对其编码的蛋白质含量检测来确定［3］。针对脂肪酸的β-氧化抑制，可通过检测酮体含量和荧光标记的中性脂质在细胞质中的积累来实现［18］。

大多数线粒体毒性终点检测都是采用HepG2细胞或分离的线粒体。分离的线粒体因缺乏细胞环境，所得结果可能具有误导性。Hynes等［19］分别以细胞和分离的线粒体为模型，检测化合物进行线粒体毒性检测。结果显示，多个化合物在分离的线粒体中显示出毒性，而在细胞模型中未检测到线粒体毒性，这可能与孤立的线粒体缺乏药物代谢系统以及药物更易干扰电子传递链有关。Marroquin等［20］研究表明，以半乳糖代替葡萄糖作为细胞生长的碳源，能够迫使细胞通过氧化磷酸化而不是糖酵解产生ATP，可显著提高HepG2细胞对线粒体毒物的敏感性，这种测定现已广泛应用。但也有研究者认为，这种急性毒性检测方法可能无法确定代偿机制、药物蓄积或对线粒体呼吸功能长期抑制的影响［13］。尽管有证据表明，体外检测中许多药物会影响线粒体功能，但迄今为止药物致线粒体毒性的体内外相关性的报道信息仍然较少。部分原因是现有的检测技术方面的局限性，以及体外检测中所用的药物浓度较高而导致检测结果有较高的假阳性率。Prill等［21］开发了一种肝细胞微流体生物反应器，可通过与药物长期孵育，借助双频调相传感技术，实时监测线粒体呼吸氧气动力学参数，揭示了药物重要的作用机制。这种模拟人体生理环境的长期重复给药和毒性终点的实时监测，可能会改善体内外相关性，并且可以解决短期测定和高药物浓度相关的问题。

3 胆汁淤积检测终点

药物通过干扰胆酸的合成、代谢和转运，使胆汁在肝内或循环系统过度积累，从而导致胆汁淤积。药物对胆汁淤积的影响与胆盐转运蛋白的抑制密切相关，特别是对ATP依赖的胆盐输出泵（bile salt export pump，BSEP）的抑制，如波生坦、曲格列酮和奈法唑酮等［22-23］。此外，有些药物也可增加毛细胆管膜的通透性，使胆汁分泌减少；或破坏胆汁混合胶束形成胆管结石，造成胆管损伤和梗阻［24］。药物导致的胆汁淤积往往涉及炎症和自身免疫反应，严重者可能导致纤维化和肝硬变。

鉴于BSEP在调节胆酸平衡中的重要作用，许多制药公司已将BSEP抑制实验纳入候选药物或新化学实体的筛选程序中。通常使用三明治构型培养的肝细胞或转运蛋白过表达的囊泡系统来定量评估BSEP与化合物的相互作用。然而实际情况下，一些药物是BSEP抑制剂，但临床并未发现导致胆汁淤积，如噻唑烷二酮类药物均能抑制BSEP，但吡格列酮被认为不会引起肝毒性［25］，可能的原因一是体外实验中药物暴露的浓度过高，与实际治疗剂量下体内肝暴露量不符；二是BSEP过表达的囊泡系统未考虑对胆汁酸稳态相关的其他转运蛋白活性的影响，这导致单独筛选与BSEP抑制有关的毒性时假阳性数量很多［25］。将多药耐药相关蛋白（multidrug resistance-associated protein，MRP）2，3和4等并入转运蛋白抑制实验中，能够改善预测结果［26］。Xu等［27］开发了一种胆汁流定量成像分析方法，3D培养的人原代肝细胞与化合物孵育，借助胆盐类似物胆酰赖氨酰荧光素与转运蛋白结合后产生荧光，采用高内涵筛选技术，可以定量检测化合物对胆汁转运的抑制作用。Zhang等［28］开发了一种胆汁转运活性检测法，原代肝细胞培养基中加入定量的甘氨酸和牛磺酸，细胞用药物处理后，借助液相-二级质谱联用（LC-MS/MS）检测胆酸分别在培养基和细胞中的量，可用于评估药物对细胞胆盐转运的影响，同时也证实不同物种的原代肝细胞实验结果与人原代肝细胞相比有较大差异。

虽然这些研究改善了预测结果，但开发可靠的胆汁淤积筛选方法仍面临挑战，目前尚未研究出有效评估胆管损伤的方法。原因之一是体外建立胆汁流动所需的肝细胞-胆管细胞网络结构较困难；其次是胆道损伤本身的机制、多因素的肝内胆汁淤积与胆道损伤的关联很大程度上仍是未知的［28］。研究表明，3D培养的原代肝细胞和HepaRG细胞，具有用于研究胆汁淤积的重要生理学特征，包括转运蛋白相关的基底外侧极性和胆小管膜，以及胆汁酸及胆管样结构的形成［29］。此外，这种三维结构使肝细胞能长期维持其功能及表型［29］，其单独培养或与其他非实质细胞共培养模型未来可能会成为研究慢性胆汁淤积及胆管损伤的重要工具。

4 代谢相关检测终点

肝是机体最主要的代谢器官，临床上由于DILI导致撤市或标注黑框警告的药物，大部分被证明会产生反应性代谢物［30］。一些母体药物本身无毒，但在肝代谢过程中可形成高度不稳定的活性代谢物，可能与肝中重要大分子共价结合并阻断其功能，诱导肝细胞损伤。同时，共价修饰的蛋白可能会形成半抗原，触发免疫反应［31］。反应性代谢物与GSH共轭结合被解毒或造成GSH耗竭，使细胞更易受其他环境压力的影响。有多项研究表明，药物临床每日剂量≥100 mg会加剧肝毒性风险［30-32］，这可能与机体对反应性代谢物的清除率和耐受性有关。此外，有些药物通过氧化代谢会产生自由基，诱导细胞氧化应激和（或）脂质过氧化。

在药物发现早期进行反应性代谢物形成的体外筛选，通过对先导化合物合理的结构修饰，可最大限度地减少代谢活化造成的DILI风险。大部分反应性代谢物和自由基，因高度不稳定、半衰期短而难以检测，可采用亲核捕获试剂与之形成稳定的加合物后再进行检测。GSH及其类似物是常用的捕获试剂，此外还有醛或亚胺结构的化合物，被捕获的代谢物可通过LC-MS/MS和核磁共振等技术进行定量检测或结构鉴定［31］。代谢物与肝蛋白的共价结合是另一个重要的检测终点，药物与添加了辅因子的肝微粒体或新鲜分离的肝细胞共孵育，可通过LC-MS/MS检测共价加合物的水平［33］。由细胞色素P450（cytochrome P450，CYP450）介导的代谢形成的反应性代谢物可导致酶的可逆或不可逆性失活，通过检测待测化合物对CYP同工酶特异性底物的消耗或其产物的生成，能够确定反应性代谢物对CYP450的作用位点及药物代谢性相互作用［34］。常用的体外代谢相关的肝毒性检测模型为肝微粒体、S9混合物或肝匀浆。一些研究支持使用肝细胞进行生物活化检测，因其能够保持CYP450和药物代谢完整的相互关系，能表现出适当的代谢解毒与生物活化之间的平衡，如人原代肝细胞、药物代谢酶工程改造的细胞系以及hiPSC分化的肝细胞等已被广泛应用于代谢性DILI的研究。

5 免疫相关的检测终点

DILI可分为2种，一种是具有剂量依赖性的固有型DILI，另一种是具有复杂的量效关系或者无明显的量效关系，临床上仅发生在少数患者中且临床前难以预测，称为IDILI。IDILI的确切机制仍不明确，但可以肯定的是，IDILI很多情况下会涉及免疫系统的参与，其发生机制可能与“危险信号假说”有关［35-36］。该假说认为，反应性代谢物与肝细胞或载体蛋白共价结合形成半抗原（第一信号），加上反应性代谢物造成的肝细胞损伤和肝微环境的失调，作为共刺激信号（第二信号）引起对加合蛋白的适应性免疫应答，产生自身抗体或免疫细胞介导的细胞毒作用，最终导致肝损伤。免疫介导的DILI的个体差异性，则与患者药物代谢酶或转运体的基因多态性、宿主对药物免疫应答的反应性以及患者疾病状态等因素有关［35］。

鉴于临床IDILI的严重程度和不可预知性，迫切需要早期体外筛查和非临床实验来辅助预测和风险评估。免疫毒性终点如肿瘤坏死因子、白细胞介素、干扰素和S100钙结合蛋白A9等细胞因子虽可以在细胞培养基中检测，但免疫介导的DILI的体外检测模型明显缺乏。主要原因是免疫介导的DILI是一个涉及肝内和肝外信号关联以及遗传多样性的复杂过程。最近有报道称，人胚胎干细胞分化的肝细胞用对乙酰氨基酚处理后，能够分泌炎症细胞因子，且其培养基能够活化Jurkat，THP-1和NK92MI人免疫细胞系，这为开发用于免疫介导的DILI检测模型提供了设想［37］。人类白细胞抗原（human leuko⁃cyte antigen，HLA）等位基因相关性分析显示，HLA基因多态性与患者IDILI的适应性免疫应答存在关联。如HLA-DRB1＊15：01-HLA-DQB1＊06：02（阿莫西林-克拉维酸盐）［38］，HLA-B＊57：01（氟氯西林）［39］和HLA-DRB1＊07：01（希美加群）等［40］。这些等位基因的表达虽使一些患者偏向于DILI，特定HLA等位基因的存在增加患者对DILI的敏感性的确切分子机制仍然不明确，有待进一步研究。

6 体外肝毒性的综合风险评估

综上可见，基于线粒体毒性、胆汁淤积、代谢和免疫反应不同机制基础的体外肝毒性检测终点有多种（表2），但在新药研发的实际应用中，选用哪些终点组合以获得最准确的DILI检测结果，是一个风险与收益相平衡的过程。目前不同的制药公司采取不同的组合策略进行综合风险评估。例如，罗氏制药的科学家［43］报道了他们对候选化合物的DILI风险评估方法，包括CYP3A4时间依赖性抑制和GSH加合物形成，BSEP的抑制，NIH 3T3成纤维细胞的线粒体毒性，以及人肝细胞和NIH 3T3成纤维细胞的常规细胞毒性检测。辉瑞的研究人员［44］综合检测化合物的常规细胞毒性，BSEP抑制，以及分离的肝线粒体解偶联和耗氧量抑制，并指出多个检测终点同时出现阳性及临床治疗剂量较大的化合物具有较高DILI风险。而Aleo等［22］将线粒体毒性和BSEP的抑制作为肝毒性评估的重点。虽然不同的研究机构采用的评估策略尚未达成一致，但可以肯定的是，采用任何单一机制的毒性终点不足以准确预测DILI。对现有的检测终点进行联合评估验证及标准化管理，将为其在新药开发中的实际应用提供保障。

表2 不同机制基础的体外肝毒性检测终点

7 体外评价肝毒性检测终点面临的挑战

虽然有诸多检测终点用于DILI的体外评价，但其可靠性及与临床结果的相关性仍不十分明确，体外毒性信号的解释以及如何影响后续的药物开发决定仍面临挑战。主要表现在以下几点：①目前使用的体外肝毒性预测模型无法充分再现肝在体内的复杂特性。需要开发能够长时间维持肝细胞结构及代谢能力的系统，以求体外预测中的阳性信号能够尽可能地反映体内的毒性机制或作用模式。②难以确定体外检测适当的浓度和阈值。以过高剂量标示化合物具有肝毒性是片面的，需要考虑临床暴露数据以预测临床治疗剂量是否安全，而在研发早期阶段，临床暴露量的估算具有很大的不确定性。③与DILI相关的药物分类尚不明确。体外检测终点的验证取决于于该终点能否区分临床上与DILI明确相关的一组化合物，但临床上缺乏能够准确识别DILI药物的“金标准”，各国需要加强药物安全信息的沟通，以求准确识别具有潜在DILI的药物。④现有的临床肝功能检测指标与体外检测终点相关性不明确。传统的肝生化指标谷丙转氨酶、谷草转氨酶和γ-谷氨酰转移酶等因在体外检测中高度可变［45］，通常不作为体外肝毒性检测终点，这限制了体外检测结果向体内的转化。

8 结语

体外DILI的预测在新药开发早期先导化合物的筛选以及后期临床肝毒性信号的解释具有不可替代的作用，其检测终点的选择决定着预测结果的可靠性。新兴工具的应用大大提高体外检测终点的可靠性。新型器官型肝培养平台，如3D结构的肝细胞和微流控肝芯片等模型，能够长期稳定维持肝细胞结构和（或）代谢能力，从而在更接近生理状况下发现具有较长潜伏期的、诱导中低水平肝毒性的药物。基于细胞成像的高内涵筛选技术，能够对单细胞群实现多参数和多靶点分析，通过监测多种信号通路阐明细胞损伤机制，现已用于常规细胞毒性、线粒体毒性及胆汁淤积毒性的研究。毒物基因组学、代谢组学和蛋白质组学等生物信息学能够研究机体受外部刺激或内部基因改变所产生的整体变化，有助于发现新的可转化的肝生物标志物。此外，个体因素与IDILI之间的相互作用关系仍然很不明确，未来个体基因型对发病机制的影响将考虑纳入预测实验。总之，我们期待能有更完善的预测工具和标准化策略来改善体外肝毒性检测，从而为后续的药物开发提供指导。

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