丹参总酚酸诱导PC12细胞分化机制

沈 杨＊，张 琦＊，赵佳奇，田雅娟，李钦青，楚世峰，贺文彬

（1.山西省中医药研究院，山西太原 030012；2.山西中医药大学中医脑病学山西省重点实验室&脑藏象学山西省高等学校重点实验室，山西太原 030619；3.中国医学科学院药物研究所，北京 100050）

丹参（Radix Salviae Miltiorrhizae）属于唇形科鼠尾草属植物，又名大红袍、红根赤参、血丹参等，是我国常用的中药之一，始载于《神农本草经》，性苦，微寒，归心、肝经［1］。研究表明，丹参具有较强的清除氧自由基抗氧化的作用［2］，对于因缺糖缺氧所致的神经元细胞损伤具有一定的保护功效［3］，其延缓衰老及改善记忆的作用也得到相应实验的证实［4］。我们的前期研究表明，脂溶性丹参酮类成分丹参总酚酸（total salvianolic acids，Tsa）可通过抑制缺血侧脑区的免疫炎症反应和免疫细胞浸润，改善外周免疫抑制，从而减轻脑卒中后继发性炎症反应，提高脑卒中患者的生活质量［5］，对于调节中枢神经系统及营养神经元具有一定的意义。

PC12细胞是目前广泛用于研究神经细胞分化及凋亡的细胞模型［6-7］，研究药物对PC12细胞的促分化作用是神经药理学中证明药物具有神经可塑性的有力证据。有研究表明，神经生长因子（nerve growth factor，NGF）可促进PC12细胞增殖分化［8］，并且其分化作用是通过激活细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）蛋白所产生的［9］。丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinas，MAPK）是研究细胞分化及损伤的常涉及的信号通路，其中ERK1/2与细胞增殖分化关系最密切［10］。但是，对于具有延缓衰老及改善记忆作用的丹参及其有效成分Tsa能否影响PC12细胞的增殖和分化，及其是否与ERK1/2蛋白相关，至今未见报道。

许多中草药，如人参［11］、灵芝［12］和菟丝子［13］等提取物均有类NGF的作用，能促进PC12细胞分化。因此，本实验以Tsa处理PC12细胞，探讨Tsa对PC12细胞的影响及其作用机制。

1 材料与方法

1.1 药物、细胞株、试剂和主要仪器

Tsa由中国医学科学院药物研究所提供；未分化的PC12细胞由中国医学科学院药物研究所陈乃宏教授惠赠；DMEM与N2培养基购自于美国Gib⁃co；NGF（苏肽生，舒泰神北京生物制药公司）；马血清、胎牛血清（Hyclone，美国）；胰蛋白酶（武汉博士德公司）；兔抗鼠微管相关蛋白质2（microtubuleassociated protein2，MAP-2）多克隆抗体（Protein⁃tech，武汉三鹰）；兔抗鼠ERK1/2、磷酸化ERK1/2（phosphorylated ERK1/2，p-ERK1/2）、兔抗鼠MAPK激酶1/2（MEK1/2）和p-MEK1/2单克隆抗体（Cell Signaling，美国）；羊抗兔IgG二抗（武汉博士德）；ECL Western蛋白印迹化学发光检测试剂盒、免疫印迹检测试剂盒（江苏康维公司）；U0126（Sigma，美国），其余试剂均为进口或国产分析纯。

Cytation5细胞成像微孔板检测仪（BioTek，美国）；CKX31SF、IX73显微镜（Olympus，日本）；Thermo371培养箱，X1R低温高速离心机（Thermo，美国）；HHS-11-6电热恒温水浴锅（上海博迅）。

1.2 PC12细胞的培养

PC12细胞于DMEM高糖培养基（含5%胎牛血清，5%马血清，青霉素100 U ·L-1，链霉素100 mg ·L-1）37℃，5%CO2及饱和湿度的细胞培养箱中培养，隔天更换培养基，待单层培养细胞生长至80%以上后传代培养。

1.3 MTT法检测PC12细胞存活

取对数生长期的PC12细胞，以5×107L-1接种于96孔板，每孔100 μL置于37℃、CO2培养箱。细胞贴壁后，分为4组，每组3个复孔，分别为正常对照组、Tsa 0.01，0.1和1.0 μg·L-1，按分组加药后置于培养箱（37℃，5%CO2）中培养，24 h后，去上清液，分别加入10 μL MTT标记液（50 g·L-1），置于培养箱培养4 h后，再加入120 μL的DMSO，37℃振荡15 min，使蓝紫色甲臜充分溶解，于酶标仪测定570 nm条件下吸光度A570nm值。实验重复3次。细胞存活率（%）=实验组A570nm/正常对照组A570nm×100%。

1.4 氧糖剥夺（oxygen and glucose deprivation，OGD）损伤模型的建立和分组

取对数生长期的PC12细胞，以5×107L-1接种于96孔板，每孔100 μL实验分为正常对照组、OGD 模型组、OGD+Tsa 0.01，0.1和1.0 μg ·L-1组。按预实验用含Na2S2O415 mmol·L-1的无糖Earle′s液建立PC12细胞的OGD损伤模型，即每孔用PBS冲洗3次后加入200 μL的Na2S2O4无糖Earle′s液，置于培养箱（37℃，5%CO2）中培养2 h，即OGD损伤模型。Tsa处理组于OGD损伤2 h后加入终浓度为0.01，0.1和1.0 μg ·L-1的Tsa，作用24 h后，进行MTT实验，检测细胞存活率。

1.5 显微镜下观察PC12细胞分化

为排除血清促进PC12细胞分化的影响，实验采用无血清的N2培养基进行实验。以5×107L-1细胞接种96孔板，每孔100 μL实验分为N2培养基对照组、Tsa 0.01，0.1和1.0 μg·L-1组、NGF 50 μg·L-1（阳性对照）组。每2 d换液1次，加入Tsa 24 h后，分析每组细胞突起生长情况，并做统计分析。在显微镜下随机选择每孔的3个视野，观察细胞突起的生长情况，若细胞出现1个或多个突起，即视为细胞分化。细胞分化率（%）=每视野分化细胞数/该视野总细胞数×100%。实验重复3次。

1.6 Western蛋白印迹检测MAP-2，p-ERK1/2，ERK1/2，p-MEK1/2和MEK1/2蛋白表达

收集经Tsa或NGF处理24 h的PC12细胞，并用PBS洗涤3次，加入200 μL裂解液，冰浴30 min（每10 min混匀一次），4℃下24476×g离心30 min，收集上清，贮于-20℃备用。再加入上样缓冲液，100℃煮沸10 min后取出。样品的蛋白定量使用BCA Protein Assay Kit（武汉博士德公司）。聚丙烯酰胺凝胶电泳，选择与相对分子质量相符的分离胶浓度。蛋白转印，应用电转印法将电泳条带转移到聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上。用5%牛血清白蛋白封闭PVDF膜非特异性抗原，加一抗（兔抗鼠MAP-2多克隆抗体1∶1000，p-ERK1/2、ERK1/2单抗 1∶1000，p-MEK1/2、MEK1/2单抗1∶1000）孵育、洗涤、加二抗（羊抗兔HRP-IgG 1∶2000）、孵育、洗涤。ECL化学发光显影：用ECL试剂盒按说明书方法进行显影曝光。采用GelPro 31对目的蛋白条带进行积分吸光度（integrated ab⁃sorbance，IA）分析。待测蛋白相对表达水平用IA目标蛋白/IA内参蛋白比值表示。

1.7 Western蛋白印迹检测MEK抑制剂U0126对ERK1/2蛋白表达的影响

将细胞组分为正常对照组，U012610 μmol· L-1组，Tsa 1.0 μg ·L-1组及U0126+Tsa组。在实验前加入MEK抑制剂U0126，2 h后加入Tsa，收集细胞样本，实验步骤同1.6。

1.8 统计学分析

计量资料以±s表示，应用SPSS17.0统计软件，采用单因素方差分析，组间比较采用t检验，以P＜0.05为有统计学显著差异。

2 结果

2.1 Tsa对PC12细胞存活的影响

MTT结果显示（图1），Tsa 0.01，0.1和1.0 μg·L-1作用24 h后，与正常对照组相比，Tsa 1.0 μg·L-1组PC12细胞的存活率升高90%（P＜0.01），Tsa 0.01和0.1 μg·L-1组细胞的存活率与正常对照组无统计学差异。提示Tsa 0.01，0.1和1.0 μg ·L-1对PC12细胞均无药物毒性，Tsa 1.0 μg·L-1可促进细胞增殖。

Fig.1 Effect of total salvianolic acids（Tsa）on survival rate of PC12 cells.PC12 cells were treated with Tsa for 24 h.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with normal control group.

2.2 Tsa对OGD损伤的PC12细胞的修复作用

与正常对照组相比，OGD模型组细胞存活率明显降低（P＜0.01），提示造模成功。与模型组相比，Tsa 0.1和1.0 μg ·L-1组细胞存活率分别上升至（47.7±1.8）%和（63.2±13.0）%（P＜0.05，P＜0.01），Tsa 0.01 μg ·L-1组细胞存活率无明显改变（图2）。提示Tsa 0.1和1.0 μg ·L-1对OGD损伤的PC12细胞具有修复作用。

Fig.2 Effect of Tsa on oxygen-glucose deprivation（OGD）injured PC12 cells.OGD injured PC12 cells were cultured by using Na2S2O415 mmol·L-1in Earle′s without sugar for 2 h.Then Tsa was added and acted for 24 h，respectively.±s，n=3. ＊＊P＜0.01，compared with normalcontrolgroup； #P＜0.05，##P＜0.01，compared with OGD model group.

2.3 Tsa对PC12细胞分化的影响

N2培养基对照组的PC12细胞无明显突起生成。Tsa处理PC12细胞24 h后，Tsa各浓度组的PC12细胞有多个细长突起生长（＞1倍胞体直径）（P＜0.01），呈现神经元形态特征（图3）。提示Tsa能促进PC12细胞分化；但该作用与NGF 50 μg·L-1阳性对照组相比相对较弱（P＜0.01）。

Fig.3 Effect of Tsa on differentiation of PC12 cells.PC12 cells in N2 medium were untreated or treated with Tsa and NGF（positive control）for 24 h respectively.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with N2 medium control group；##P＜0.01，compared with NGF 50 μg·L-1group.

2.4 Tsa对PC12细胞MAP-2，p-ERK1/2，ERK1/2，MEK1/2和p-MEK1/2蛋白表达的影响

Western蛋白印迹结果显示（图4），Tsa作用于PC12细胞24h后，与正常对照组相比，Tsa1.0μg·L-1组 MAP-2蛋白表达升高（P＜0.01）。Tsa 0.1和1.0 μg ·L-1组的p-ERK1/2蛋白表达升高（P＜0.01），但Tsa各组ERK1/2总蛋白表达无统计学差异。

Tsa作用PC12细胞24 h后，与正常对照组相比，Tsa各组p-MEK1/2蛋白的表达增加（P＜0.05，P＜0.01），但MEK1/2总蛋白表达无统计学差异。

Fig.4 Effect of Tsa on expressions of microtubuleassociated protein2（MAP-2），extracellular signal-regu⁃lated kinase1/2（ERK1/2），phosphorylated ERK1/2（p-ERK1/2），mitogen-activated protein kinase kinase1/2（MEK1/2）and p-MEK1/2 in PC12 cells by Western blotting.See Fig.1 for the cell treatment.A2，B2 and C2 were the semi-quantitative results of A1，B1 and C1，respectively.±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with normal control group.

2.5 MEK抑制剂U0126对Tsa诱导的PC12细胞ERK1/2蛋白磷酸化的影响

U012610 μmol·L-1作用PC12细胞1 h 后，加入Tsa 1.0 μg ·L-1作用6 h，结果显示（图5），与正常对照组相比，Tsa 1.0 μg ·L-1组p-ERK1/2蛋白表达明显升高（P＜0.01），U0126抑制剂组p-ERK1/2蛋白表达明显降低（P＜0.01）；与Tsa 1.0 μg ·L-1组相比，Tsa 1.0 μg ·L-1+U0126组p-ERK1/2蛋白表达明显降低（P＜0.01），提示抑制剂可抑制Tsa诱导的p-ERK1/2的表达。

Fig.5 Effect of U0126 on expressions of ERK1/2 and p-ERK1/2 induced by Tsa 1.0 μg ·L-1.PC12 cells were pretreated with U012610 μmol·L-1and then treated with Tsa 1.0 μg·L-1 for 6 h.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with corresponding normal con⁃trol group；##P＜0.01，compared with corresponding Tsa 1.0 μg ·L-1 group.

3 讨论

本研究发现，Tsa可促进PC12细胞的增殖，对OGD损伤细胞具有修复作用。不同浓度的Tsa均能诱导PC12细胞突起生长，Tsa处理后均能激活PC12细胞MAP-2的表达，提示Tsa具有类NGF的作用。

有研究表明，NGF能激活Raf/MEK/ERK信号通路从而导致PC12细胞分化增殖［14］。Raf/MEK/ERK通路是MAPK通路中的一条重要分支，可被各种生长因子激活，与促进细胞分化关系密切［10，15］。Western蛋白印迹检测结果发现，不同浓度Tsa均可激活p-ERK1/2及其上游p-MEK1/2蛋白。加入MEK抑制剂U0126后，发现p-ERK1/2的表达可被抑制，提示Tsa诱导PC12细胞增殖分化的作用方式可能与NGF相似，即是通过调控ERK1/2蛋白来激活MAPK信号通路。

然而，在本研究中，Tsa虽对PC12细胞具有促进增殖分化的作用，但其促进分化的效果弱于NGF。传统中药配伍理论认为，将性能功效相类似的药物配合使用可增强其疗效，称这种作用为“相须”。有研究者提出，除了单方以外，单味中药作为组成方剂的原料，其在不同方剂中所表达的药效不同［16］；也有研究发现，Tsa与三七总皂苷配伍后，其修复缺氧缺血心肌细胞的作用有所增强［17］。推测Tsa与其他药物相须配伍后，或可起到协同增效作用，从而在促进细胞分化作用上与NGF达到同一水平。另外，本研究未将Tsa作用于原代细胞证明其诱导细胞分化，后续研究会将2种实验进行对比，进一步证明Tsa的促分化作用。

综上所述，Tsa能促进PC12细胞的增殖及分化，其作用与NGF相似。

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