正清风痛宁对骨关节炎动物模型ADAMTs-4、ADAMTs-5表达的影响

陈志军，张大华(西安医学院第一附属医院，西安 710077)

骨性关节炎是常见的退行性关节病变，主要病理改变为关节软骨进行性变性破坏、边缘骨赘形成和关节腔间隙狭窄，同时伴有不同程度的滑膜炎症，临床表现为膝关节疼痛和功能障碍，严重者可导致膝关节畸形甚至残疾[1]。目前西医治疗骨关节炎以激素、非甾体类抗炎药、手术等为主，尚缺乏完全治愈的有效方法，联合中医药治疗可延缓关节炎的病理进程，改善治疗预后[2]。正清风痛宁是从中药清风藤中提取的有效成分，主要药用成分为盐酸青藤碱，具有抗炎、镇痛、免疫调节等多种作用，联合非甾体类抗炎药治疗骨关节炎具有肯定疗效，但其药理研究多集中于抗炎消肿、抗T淋巴细胞增殖等方面，其药理作用尚有待进一步研究探讨[3 - 4]。研究[5]显示，骨关节炎关节软骨退化的主要病理改变为软骨外基质降解和聚蛋白多糖的丢失，聚蛋白多糖酶家族是软骨基质聚蛋白多糖的主要降解酶，与关节软骨退变程度呈正相关，聚蛋白多糖酶-1和聚蛋白多糖酶-2均属于凝血酶敏感蛋白基序去整联蛋白域和金属蛋白酶域蛋白(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs, ADAMTs)家族，故又分别命名为ADAMTs-4和ADAMTs-5。目前正清风痛宁对ADAMTs的影响目前尚未见报道，因此本实验通过对正清风痛宁干预下实验动物膝关节软骨组织ADAMTs-4、ADAMTs-5的mRNA表达进行分析，旨在进一步探讨正清风痛宁治疗骨性关节炎的作用机制，现将结果报告如下。

1 材料和方法

1.1 实验动物

普通级4月龄新西兰兔48只，雌雄各半，体重2.5～2.7 kg，由西安交通大学医学部实验动物中心提供[SCXK (陕) 2017-0014]，西安交通大学医学部实验动物中心[SYXK (陕) 2017-0102]分笼饲养，保持12 h昼夜节律，室温(22±1)℃，自用饮水、摄食。并按实验动物使用的3R原则给予人道的关怀，西安交通大学实验伦理委员会批号：2017-0016。各组在兔龄、体重、饲养条件等一般资料方面差异均无显著性(P> 0.05)，具有可比性。

1.2 主要试剂与仪器

正清风痛宁(每片20 mg，湖南正清制药集团股份有限公司)；Trizol(美国Invitrogen公司)；DHEA(Fluka公司)；RevertAIDTMFirst strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas公司)；聚合酶链反应试剂(北京全式金生物技术有限公司)；GAPDH内参和ADAMTs-4、ADAMTs-5引物由大连宝公司合成。石蜡包埋机(Sakura)；LKB超薄切片机(Bio-Rad公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 动物分组

随机取16只兔作为正常对照组不予处理，建模成功后将建模成功的兔随机选取32只分为模型组和观察组，每组16只，各组在兔龄、性别、体质量、饲养条件等一般资料方面差异均无显著性(P> 0.05)，具有可比性。

1.3.2 建立骨关节炎模型

采用膝关节制动造模方式[6]制造兔膝骨性关节炎模型，造模前实验动物禁食10～16 h，3%戊巴比妥钠溶液按30 mg/kg剂量耳缘静脉注射麻醉，左后肢踝关节以上剪毛后牵拉膝关节处于伸直位，速干型石膏绷带经热水浸泡软化后自腹股沟至趾头固定，以膝关节伸直180°、踝关节背屈60°，固定后暴露出足趾观察血液供应情况，石膏绷带外用弹力医用绷带封好，防止实验动物撕咬，制动时间6周，6周后拆除所有绷带，随机抽取一只实验动物处死，取关节软骨进行病理观察。造模成功标准[7]：病变关节软骨清表区粗糙或有炎性肿胀，产生裂隙，深达辐射区，深层细胞数目异常。

1.3.3 药物干预

空白组给予10 mL生理盐水灌胃。观察组给予正清风痛宁治疗，每片含生药20 mg，成人用药每日120 mg，根据Meeh-Rubner公式计算给药剂量：成人按60 kg计算，体表面积=10.6 × (60 0002/3)/10 000=1.625 m2，每日应用剂量(g/m2)=120 mg/1.625 m2=73.85 mg/m2，3.0 kg兔体表面积=10.1 × (30002/3)/10 000=0.2101 m2，3.0 kg兔每日剂量(g)=0.2101 m2× 73.85 mg/m2=15.52 mg，每日取15.52 mg正清风痛宁溶于10 mL生理盐水灌胃。模型组每日给予同等剂量生理盐水灌胃。连续用药4周。

1.3.4 大体观察

药物干预4周后，用3%戊巴比妥麻醉实验动物，分离膝关节软组织，暴露关节面，观察关节形态、关节液、关节软骨，关节软骨分级标准[8]见表1。

1.3.5 光镜观察

大体观察后取胫骨近端部分关节软骨，经脱钙、石蜡包埋、切片、HE染色后制成病理切片，光镜下观察，每张图片取2个视野，按Mankin’s评分标准[9]对软骨结构(0～3分)、软骨细胞数量(0～3分)、潮线(0～3分)进行评分，得分越高说明病变越严重。

1.3.6 RT-PCR测定

取股骨内髁软骨组织约10 mg至1 mL Trizol中匀浆，按说明书提取总RNA，PCR扩增，95℃预变性反应5 min，每个循环变性94℃ 45 s，最佳退火温度45℃，链延伸72℃ 45 s反应，进行35个循环，最后72℃反应10 min，扩增产物在2%球脂糖凝胶电源，利用凝胶电源成像系统图像采集和电源灰度测定，计算目的条带和内参照条带灰度值之比，进行半定量分析。GAPDH、ADAMTs-4、ADAMTs-5引物序列和退火温度见表2。

表1 关节软骨分级标准Tab.1 Grading standard of articular cartilage

表2 GAPDH、ADAMTs-4、ADAMTs-5引物序列和退火温度Tab.2 Primer sequences and annealing temperature of the GAPDH, ADAMTs-4 and ADAMTs-5

表3 三组关节软骨分级比较Tab.3 Comparison of articular cartilage grading of the three groups

注：与空白组相比，aP< 0.05；与模型组相比，bP< 0.05。

Note.Compared with the blank group,aP< 0.05. Compared with the model group,bP< 0.05.

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 大体观察

空白组膝关节无肿大，关节表面光滑整齐，无滑膜增生、骨赘形成，关节软骨透明，关节液量少，色淡黄清亮；模型组关节软骨色泽变暗，关节软骨磨损严重，部分骨质外露，软骨边缘有骨赘形成，关节液明显增多，色泽浑浊；观察组关节软骨表面粗糙不平，未见明显骨质外露，滑脉有不同程度增生，关节液有所增多，色泽浑浊。Radit分析显示，空白组、模型组和观察组关节软骨分级相比较差异有显著性(P< 0.05)，见表3、图1。

2.2 光镜检查

光镜检查结果和Mankin’s评分见表4，模型组Mankins’s评分高于空白组和观察组，观察组Mankin’s评分高于空白组，差异有显著性(P< 0.05)。见表4、图2。

2.3 三组ADAMTs-4和ADAMTs-5 mRNA表达相比较

模型组ADAMTs-4和ADAMTs-5 mRNA表达显著高于观察组和空白组，观察组ADAMTs-4和ADAMTs-5 mRNA表达显著高于空白组，差异有显著性(P< 0.05)。见表5、图3。

图1 三组关节软骨形态Fig.1 Articular cartilage morphology in the three groups

表4 三组光镜检查结果和Mankin’s评分相比较Tab.4 Comparison of light microscopic results and Mankin’s scores of the three groups

注：与空白组相比，aP< 0.05；与模型组相比，bP< 0.05。

Note.Compared with the blank group,aP< 0.05. Compared with the model group,bP< 0.05.

图2 三组光镜检查结果Fig.2 Microscopic morphology of cartilages in the three groups

表5 三组ADAMTs-4和ADAMTs-5 mRNA表达相比较Tab.5 Comparison of expressions of ADAMTs-4 and ADAMTs-5 mRNA between the three groups

注：与空白组相比，aP< 0.05；与模型组相比，bP< 0.05。

Note.Compared with the blank group,aP< 0.05. Compared with the model group,bP< 0.05.

图3 三组ADAMTs-4和ADAMTs-5 mRNA表达Fig.3 Expression of ADAMTs-4 and ADAMTs-5 mRNA in the three groups

3 讨论

聚蛋白多糖拥有巨大分子量，被网在胶原蛋白网架中与散居其中的软骨细胞共同构成关节软骨，聚蛋白多糖丢失是软骨破坏主要病理生理表现，引起蛋白聚多糖降解的原因很多，蛋白水解酶活性增高是主要因素[10]。既往研究认为基质金属蛋白酶是降解聚蛋白多糖的主要酶类，近年来的显示ADAMTs在聚蛋白多糖降解和骨关节炎发病中发挥更重要的作用，骨性关节炎不同时期关节液中ADAMTs-4和ADAMTs-5作用的降解产物ARGXX均高于基质蛋白酶降产物FFPGXX[11 - 12]。体外培养软骨细胞的研究[13]显示，抑制ADAMTs-4和ADAMTs-5水平可显著减少聚蛋白多糖的降解，敲除ADAMs-5基因的实验动物早期不会发生聚蛋白多糖丢失和软骨破坏[14]。骨关节炎模型研究[15]显示，早期阶段仅存在ADAMTs降解产生的NTEGE新抗原表位，不存在基质蛋白酶降解产生的VDIPEN抗原，随着ADAMTs对聚蛋白多糖的降解进展，可检测到VDIPEN抗原表位，结果说明ADAMTs对聚蛋白多糖的降解贯穿于骨关节炎发病的各个时期，基质蛋白酶仅在骨关节炎的晚期才发挥作用。因此抑制ADAMTs活性可能是骨关节炎干预的新靶点。

骨关节炎属中医“骨痹”范畴，认为中年以后，肾气渐衰精髓内亏，骨失所养，加之反复创伤劳损，风寒湿邪内侵，闭阻气血，湿凝成痰，血停为瘀，进而深注骨骱，而致关节疼痛、强直、畸形，正虚邪实，相互为用，胶结难愈，因此风寒湿是导致本病的关键因素[16]。正清风痛宁为中药清风藤的有效成分青藤碱，《本草纲目》曰：“清风藤治风湿流注，历节鹤膝……”，具有祛风通湿、活血通络、消肿止痛之功效，是治疗风湿痹痛的常用中药[17]。荟萃分析显示，正清风痛宁无论是联合用药还是单独应用治疗骨性关节炎抑制血清IL-1β和TNF-α等炎性因子的效果均优于西药，临床疗效优于西药，但目前对正清风痛宁的研究多限于对炎性因子的表达的影响，其更多作用机制尚未明确，需要进一步研究[18]。

骨关节炎动物实验和研究过程中，复制实验动物模型是研究的关键点，鼠类模型关节结构与人类不同，且关节软骨不含硫酸角质素，兔关节结构与人类接近，骨性关节炎动物模型软骨生化指标与人类似，因此本研究试验动物选择兔骨性关节炎模型[19]。切断前交叉韧带和膝关节制动是诱导骨性关节炎的两种常用方法，切断前交叉韧带可导致关节不稳，改变力学环境，导致关节退行性变，诱导骨性关节炎，关节制动在不损伤关节稳定性的情况下，通过长期固定关节，限制运动、肌肉、关节囊收缩，诱导关节软骨的萎缩性变化和骨性关节炎[20 - 22]。二者均可成功制作膝关节骨性关节炎模型，但切断前交叉韧带模型造模时间较长(需6～8周)，主要首动因素为基质分解，关节制动法造模时间短(需3～6周)，关节软骨损伤和基质分解为共同作用机制[23]。

因此，本研究采用关节制动法造成关节软骨损伤，结果显示，模型组肉眼及显微镜下均可关节软骨改变，关节软骨分级及Mankin’s评分均显著高于空白组，ADAMTs-4和ADAMTs-5水平均显著高于空白组，结果提示ADAMTs在骨关节炎的发病中发挥重要作用，与有关研究一致。本研究结果同时显示，观察组肉眼和光镜下改变均优于模型组，关节软骨分级及Mankin’s评分均低于模型组，ADAMTs-4和ADAMTs-5水平低于模型组，结果提示，正清风痛宁可通过抑制ADAMTs-4和ADAMTs-5抑制聚蛋白多糖降解，促进关节软骨修复，从而达到治疗骨关节炎的效果。

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