SIV感染猴外周血CD14+单核细胞CD169分子表达的变化

李 想，薛 婧，陈 霆，丛 喆，魏 强(中国医学科学院医学实验动物研究所，北京协和医学院比较医学中心，卫计委人类疾病比较医学重点实验室，国家中医药管理局人类疾病动物模型三级实验室，新发再发传染病动物模型研究北京市重点实验室，北京 100021)

唾液酸黏附素(sialic acid-binding immunoglobulin-type lectins, Siglecs)是宿主最大的唾液酸结合蛋白。Siglec-1，也被称作CD169，是第一个被发现的Siglecs家族的成员，主要表达于单核巨噬细胞和树突状细胞[1 - 2]。CD169可与病毒表面的某些糖蛋白结合，增强病毒与细胞的结合，从而促进病毒感染[3]。艾滋病又称获得性免疫缺陷综合征(acquired immunodeficiency syndrome， AIDS)，是由人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)引起的，HIV主要分为两种类型，即HIV-1和HIV-2，HIV-1是目前全球流行的主要病毒株。HIV-1研究中发现，机体感染HIV-1后，组织巨噬细胞和外周血单核细胞表面高表达CD169[4]。猴免疫缺陷病毒(simian immunodeficiency virus，SIV)是从灵长类动物身上分离得到的类似于HIV的病毒，SIV恒河猴模型被认为是研究艾滋病最有效的模型，而SIVmac239是常用的SIV病毒。因此，本研究观察了SIVmac239感染前后，恒河猴外周血单核细胞的比例及其表面CD169表达量的变化，分析了引起单核细胞CD169表达量变化的主要原因，以期为HIV-1/SIV感染单核巨噬细胞的研究提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 实验材料

实验动物：SPF级中国恒河猴40只，3～4岁，3～5 kg，雌雄各半，购自北京协尔鑫生物资源研究所[SCXK (京) 2015-0011]。动物饲养及相关的实验在生物安全三级实验室中进行[SYXK (京) 2015-0036]。实验前，经血清学间接免疫荧光抗体检查法(IFA)检查排除猴B病毒(BV)、猴免疫缺陷病毒(SIV)、猴逆转录D型病毒(SRV-1)和猴T淋巴细胞性I型病毒(STLV-1)等相关病原体的感染。本实验通过本单位实验动物管理和使用委员会的动物伦理审查，批准号为XJ16007。

病毒及动物接种：SIVmac239，由美国Aaron Diamond艾滋病研究中心Preston Marx博士惠赠。中国恒河猴PBMC扩增制备，CEMx174细胞滴定TCID50为每毫升3 × 105。病毒使用剂量为500 TCID50，静脉接种病毒。

样本的收集：攻毒前和静脉攻毒后第49天，采集恒河猴外周血2 mL，进行全血流式；采集正常恒河猴外周血，分离PBMC，流式分选CD14+单核细胞，用含10%胎牛血清的RPMI-1640完全培养液，37℃、5% CO2孵箱中培养。

1.2 主要试剂与仪器

Recombinant Human IFN-alpha A protein(货号：11100-1)购自R&D公司；流式抗体PE Mouse Anti-Human CD14(货号：557154)，FITC Mouse Anti-Human CD14(货号：555397)，PE Mouse Anti-Human IFN-α(货号：560097)和PerCP-CyTM5.5 Mouse Anti-Human CD16(货号：560717)购自BD公司；流式抗体APC Anti-Human CD169(货号：346008)购自BioLegend公司；Human M-CSF(货号：300-25-10UG)和Human IL-13(货号：200-13-10UG)购自Peprotech公司；Recombinant Rhesus Macaque IL-4 Protein(货号：1577-IL-010/CF)购自R&D Systems公司；流式细胞洗液(PBS Ⅱ)为含2% FBS和2 mmol/L EDTA的PBS溶液。BD AccuriTMC6流式细胞仪，BD FACSAria Ⅱ流式细胞仪，日本Hitachi CF16RXII高速离心机，Dynamica台式离心机，ESCO生物安全柜，Thermo Forma二氧化碳恒温培养箱。

1.3 实验方法

1.3.1 流式细胞术分选恒河猴外周血CD14+单核细胞[5]

(1)恒河猴外周血PBMC分离：取40 mL正常恒河猴的外周血，2500 r/min离心10 min，弃去血浆，用RPMI-1640培养液等比稀释血细胞，混匀后，每10 mL血细胞稀释液缓慢加至5 mL Ficoll液面的上方(Ficoll与稀释前血液的体积比为1∶1)，2800 r/min离心30 min，用吸管将中间单个核细胞层吸出，转移至另一新的离心管中，用不少于PBMC体积三倍的RPMI-1640培养液洗涤细胞两次，2000 r/min离心10 min，适量的RPMI-1640培养液重悬后计数。

(2)流式分选单核细胞：按20 μL抗CD14抗体/1 × 106个细胞的浓度加入抗体，混匀，4℃孵育30 min后，用PBS Ⅱ洗2次，4℃、2000 r/min离心3 min，适量PBS Ⅱ重悬后，使用BD FACSAria Ⅱ流式仪进行分选，得到CD14+单核细胞。

1.3.2 SIVmac239体外感染恒河猴外周血CD14+单核细胞[6]

取1 × 106个CD14+单核细胞置于24孔板中，1 mL完全培养液培养细胞，以100 μL的病毒用量感染细胞，混匀后置于37℃、5% CO2孵箱，培养48 h后，检测细胞表面CD169的表达量。

1.3.3 细胞因子刺激恒河猴外周血CD14+单核细胞[3]

(1)细胞因子IFN-α刺激单核细胞：取1 × 106个CD14+单核细胞置于24孔板中，1 mL完全培养液培养细胞，加入细胞因子IFN-α，使得IFN-α的终浓度为500 U/mL，48 h后检测细胞表面CD169的表达量。

(2)细胞因子M-CSF、IL-4、IL-13刺激单核细胞：取1 × 106个CD14+单核细胞置于24孔板中，1 mL完全培养液培养细胞，加入细胞因子M-CSF、IL-4和IL-13，使得M-CSF、IL-4和IL-13的终浓度均为20 ng/mL，48 h后检测细胞表面CD169的表达量。

1.3.4 流式细胞术检测细胞表面CD169分子表达量[7 - 8]

(1)全血流式：取100 μL全血，依次加入抗体PE Mouse Anti-Human CD14，PerCP-CyTM5.5 Mouse Anti-Human CD16，APC Anti-Human CD169，室温下避光孵育30 min，加入1 mL终浓度为10%的红细胞裂解液，室温作用8 min，加入1 mL PBS，2500 r/min离心5 min，弃去上清，加入2 mL PBS，2000 r/min离心10 min，适量PBS重悬过滤后BD AccuriTMC6流式细胞仪进行样本检测。

(2)胞外染色：将CD14+单核细胞从培养板中取出后，用PBS Ⅱ洗2次，4℃、2000 r/min离心3 min，调整细胞浓度为每毫升1 × 107个细胞，轻轻混匀后加入流式管内，每管100 μL。各流式管中加入相应抗体，4℃避光孵育30 min，PBS Ⅱ洗1次，PBS洗1次，PBS重悬后细胞筛过滤上机检测。

(3)胞内染色：每个流式管内加入100 μL IC Fixation Buffer，4℃孵育20 min，加入2 mL 1 × Permeabilization Buffer洗2次，4℃、2000 r/min离心3 min。100 μL 1 × Permeabilization Buffer重悬细胞后加入相应抗体，混匀后4℃避光孵育30 min，1 × Permeabilization Buffer洗2次，PBS洗1次，PBS重悬后细胞筛过滤上机检测。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 SIVmac239感染猴CD14+单核细胞表面分子CD169表达量分析

正常恒河猴经SIVmac239感染后，采集外周血，流式细胞术检测CD14+单核细胞的比例及其表面CD169分子表达量。结果显示，正常恒河猴外周血单核细胞低表达CD169，感染后，CD14+单核细胞的比例虽出现下降(P< 0.01)(图1A)，但CD14+单核细胞表面CD169的表达量却显著增加(P< 0.01)(图1B)。

注：A：SIVmac239感染前后外周血单核细胞比例的变化；B：SIVmac239感染前后外周血单核细胞表面分子CD169表达量的变化。与正常组相比，** P< 0.01，*** P< 0.001；n=40。图1 CD14+单核细胞及其表面分子CD169在SIVmac239感染后表达量的变化Note.A: Changes in the percentage of peripheral blood CD14+ monocytes before and after SIVmac239 infection. B: Changes in the expression of CD169 on the surface of peripheral blood CD14+ monocytes before and after SIVmac239 infection. Compared with the normal group,**P< 0.01,***P< 0.001. n =40.Fig.1 Changes in the percentage of CD14+ monocytes in the peripheral blood and the expression of CD169 on their surface before and after SIVmac239 infection

2.2 SIVmac239感染前后恒河猴外周血不同单核细胞亚群CD169分子表达量分析

根据外周血单核细胞CD14和CD16表达量的差异，可将单核细胞分为三种亚型，经典型CD14++CD16-、中间过渡型CD14++CD16+和非经典型CD14+CD16++单核细胞。SIVmac239感染恒河猴前后，流式检测不同亚群单核细胞比例及其表面分子CD169表达量的变化。结果显示，感染后经典型CD14++CD16-和非经典型CD14+CD16++单核细胞的比例未发生明显的变化，中间过渡型CD14++CD16+单核细胞的比例出现下降(P< 0.01)(图2 A)。三种亚型单核细胞表面CD169的表达量均出现不同程度的增高(P< 0.01)(图2B)。其中，经典型CD14++CD16-和非经典型CD14+CD16++单核细胞表面CD169表达量升高较为明显，分别为感染前的10倍和11倍(图2C)。进一步分析可知，SIVmac239感染后，非经典型CD14+CD16++单核细胞表面分子CD169的表达量明显高于经典型CD14++CD16-单核细胞(P< 0.01)(图2D)。

注：A：SIVmac239感染前后外周血不同亚群单核细胞比例的变化；B：SIVmac239感染前后外周血不同亚群单核细胞表面分子CD169表达量的变化；C：SIVmac239感染前后不同亚群单核细胞表面分子CD169表达量的比较；D：SIVmac239感染后经典型和非经典型单核细胞表面分子CD169表达量的比较。与正常组相比，*** P< 0.001，ns：差异无显著性；与CD14++CD16-CD169+相比，△△P< 0.01；n=40。图2 不同单核细胞亚群比例及其表面分子CD169在SIVmac239感染后表达量的变化Note.A: Changes in the percentage of different subsets of peripheral blood monocytes. B: Changes in the expression of CD169 on the surface of different subsets of peripheral blood monocytes. C: Comparison of the relative expression of CD169 on the surface of different subsets of monocytes. D: Comparison of the expression of CD169 on the surface of classical and non-classical monocytes after SIVmac239 infection. Compared with the normal group,***P< 0.001, ns: not significant. Compared with CD14++CD16-CD169+,△△P< 0.01. n=40.Fig.2 Changes in the percentage of different subsets of monocytes and the expression of CD169 on their surface after SIVmac239 infection

2.3 SIVmac239直接感染和不同细胞因子刺激CD14+单核细胞后CD169分子表达量的变化

正常恒河猴外周血流式分选CD14+单核细胞，细胞因子M-CSF、IL-4和IL-13等不能刺激CD14+单核细胞表面表达CD169(图3A)，但经细胞因子IFN-α刺激48 h后，细胞表面高表达CD169，阳性率达到(98.9±0.89)%(图3B)。SIVmac239体外直接感染CD14+单核细胞，未能检测到CD169表达的变化(图3C)，同时细胞内也未能检测到细胞因子IFN-α的表达(图3D)。

注：A：M-CSF、IL-4和IL-13诱导的CD14+单核细胞表面分子CD169表达量的变化；B：IFN-α诱导的CD14+单核细胞表面分子CD169表达量的变化；C：SIVmac239感染CD14+单核细胞后CD169表达量的变化；D：SIVmac239感染CD14+单核细胞后胞内细胞因子IFN-α表达量的变化。“……”：同型对照；“——”：CD169/IFN-α。图3 SIVmac239直接感染和不同细胞因子刺激的CD14+单核细胞表面分子CD169的变化Note.A: Changes in the expression of CD169 on the surface of CD14+ monocytes induced by M-CSF, IL-4 and IL-13. B: Changes in the expression of CD169 on the surface of CD14+ monocytes induced by IFN-α. C: Changes in the expression of CD169 on the surface of CD14+ monocytes after direct infection with SIVmac239. D: Changes in the expression of intracellular cytokine IFN-α of CD14+ monocytes after direct infection with SIVmac239. “……”: Isotype; “——”: CD169/IFN-α.Fig.3 Changes in the expression of CD169 on the surface of CD14+ monocytes after stimulated by different cytokines or directly infected with SIVmac239

3 讨论

单核巨噬细胞可以被HIV-1感染，成为HIV-1的潜伏感染细胞，其感染机制目前尚不完全明确。表达于单核巨噬细胞表面的CD169由于可以与病毒表面某些糖蛋白结合而促进病毒感染，从而成为HIV-1感染机制研究中的一个新的关注点。

本研究中发现，恒河猴外周血CD14+单核细胞在SIVmac239感染后比例略降低，这可能与外周血单核细胞向不同的组织迁徙分化为巨噬细胞有关[9]。同时，感染猴外周血CD14+单核细胞表面CD169的表达量显著增加，这与HIV-1感染后，组织巨噬细胞和外周血单核细胞高表达CD169的结果一致[4]。由此可见，单核巨噬细胞上表达的CD169分子确实和病毒的感染有关。

Ziegler-Heitbrock[10]根据外周血单核细胞CD14和CD16表达量的差异，将单核细胞分为三种亚型，经典型CD14++CD16-，中间过渡型CD14++CD16+和非经典型CD14+CD16++单核细胞。外周血单核细胞来源于骨髓，刚进入外周血时为经典型CD14++CD16-单核细胞，其中的一小部分分化为中间过渡型CD14++CD16+单核细胞，这类细胞最终可能分化为非经典型CD14+CD16++单核细胞，进入不同的组织，产生不同类型的终末分化巨噬细胞[11]。研究发现，非经典型CD14+CD16++单核细胞相比经典型CD14++CD16-单核细胞具有更强的吞噬能力和抗原提呈能力[9, 12]，是发育更为成熟的细胞。恒河猴经SIVmac239感染后，非经典型CD14+CD16++单核细胞中CD169表达量的升高最为明显，其表达量明显高于经典型CD14++CD16-单核细胞，推测CD14+CD16++单核细胞更强的吞噬能力和抗原提呈能力可能与CD169具有吞噬和介导抗原提呈的作用[13 - 14]有关。

本研究还发现，SIVmac239体外直接感染正常恒河猴外周血CD14+单核细胞并不能引起CD169表达的增加，而使用IFN-α刺激可诱导单核细胞高表达CD169分子。但是，SIVmac239直接感染单核细胞并不能引起其本身分泌IFN-α，而使用其它细胞因子也不能引起单核细胞表达CD169。说明恒河猴外周血单核细胞CD169表达的增加不是病毒感染直接引起的，而是体内其它免疫细胞分泌的细胞因子IFN-α引起的。

综上所述，在HIV-1/SIV感染过程中，单核巨噬细胞表面CD169的表达量发生明显变化，其表达与病毒感染机体后其它细胞释放的细胞因子IFN-α相关，因此，对CD169的进一步研究可能为HIV-1感染机制的研究提供新的思路。

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