不同栽培方式对赤灵芝多糖的影响

郭爱玲，宁慧娟，秦子芳，谭晓妍，苗雨欣，张秀清*

（1.无限极（中国）有限公司，广东 广州 529156；2.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083）

灵芝（Ganoderma lucidum），在中国古代被称为“仙草”或“瑞草”，隶属于真菌门（Eumycota）担子菌亚门 （Basidiomycotina）层菌纲 （Hymenomycetes）非褶菌目 （Aphyllophorales）灵芝菌科（Ganodermataceae）灵芝属（Ganoderma），具有独特的药用和保健价值[1]。

灵芝多糖是灵芝的重要化学成分和主要的生理活性成分，目前国内外关于灵芝的大量研究表明，灵芝多糖具有抗肿瘤、降血糖、抗氧化、免疫调节等多种作用[2－5]，其多糖含量的高低可以作为灵芝质量评价指标之一[6]。灵芝多糖的生物活性与多糖的种类、单糖的组成和多糖分子量范围等有关[7]。倪力军等[8]研究了8种中药材的多糖组成与活性，发现8种中药材多糖的单糖组成和含量具有较大差异，单糖组成与体外抗氧化活性之间存在较强的整体相关性。徐雪峰等[9]从赤灵芝多糖分离纯化得到的GLPa-2（365 kDa）、GLPb-1 （39 kDa）、GLPc（14 kDa）3个组分，主要由葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖组成，分子量最大的GLPa-2抗氧化活性最佳，表明赤灵芝多糖的抗氧化活性与其组成相关。

由于野生灵芝有限，20世纪60年代，我国开始着手灵芝人工栽培。早期的栽培方式以段木栽培为主，之后以木屑为基质进行瓶栽和袋栽，目前大多利用短段木进行栽培[10]。通过比较大段木、小段木和袋料灵芝栽培方式灵芝多糖的含量、单糖组成和分子量的差异，旨在为进一步探究不同灵芝栽培方式下灵芝多糖的生理学活性和药理价值奠定理论基础，为灵芝的合理栽培和适时采收提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

材料：赤灵芝子实体由天方健（中国）药业有限公司提供，大段木灵芝采收于安徽省大别山种植基地；小段木灵芝采收于安徽省金寨种植基地；袋料灵芝采收于山东冠县种植基地，灵芝放入烘箱经60℃烘干（水分含量＜17%），样品粉碎后过24目筛，备用。

试剂：葡聚糖（Dextran系列）标准品，美国Sigma公司；蒽酮，北京蓝弋化工产品有限责任公司；D-葡萄糖、L-阿拉伯糖等8种单糖标准品（纯度≥98%），上海源叶生物科技有限公司；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP），美国Sigma公司；三氟乙酸（TFA），北京化学试剂公司；其他试剂均为分析纯试剂。

1.2 仪器与设备

Agilent 1200高效液相色谱仪，安捷伦公司；LC-20A液相色谱仪，岛津公司；HHSY21-NY电热恒温水浴锅，北京长风仪器仪表公司；BS200S电子天平，北京赛多利斯天平公司；DHG-9240A鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司；TG16-WS高速离心机，长沙湘仪离心机仪器有限公司；TM-1901型双光束紫外可见光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；RE52AA旋转蒸发器，上海振捷实验设备有限公司；TYS-100高速多功能粉碎机，永康市红太阳机电有限公司；KQ3200DE型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 灵芝多糖的制备和测定

采用蒽酮-硫酸法[11]。称取2.000 g过24目筛的灵芝粉末，置于100 mL圆底烧瓶中，加去离子水60 mL静置1 h，沸水加热回流4 h，趁热过滤，用少量去离子水洗涤滤器和滤渣，将滤渣和滤纸置烧瓶中，加去离子水60 mL，加热回流3 h，趁热滤过，合并滤液，置水浴上蒸干，残渣用5 mL去离子水溶解，边搅拌边缓慢滴加95%乙醇75 mL，摇匀，在4℃放置12 h，8 000 r·min-1离心10 min，取沉淀烘干即为灵芝多糖样品。灵芝多糖样品用去离子水溶解并转移至50 mL容量瓶中，定容至刻度。取适量溶液，离心，精密量取上清液3 mL，置25 mL量瓶中，加水至刻度，摇匀。

标准曲线的绘制：精密称取无水葡萄糖对照品0.120 g，用去离子水定容至1 L。精密称取蒽酮0.250 g，加硫酸250 mL使其溶解，摇匀。精密量取无水葡萄糖溶液0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL，分别置于20 mL具塞试管中，各加去离子水使其体积为2.0 mL，再加入硫酸蒽酮溶液6 mL，摇匀，室温放置15 min后，置冰水浴中冷却15 min后取出，在625 nm波长处测定吸光度，以蒸馏水为空白试验对照。以葡萄糖浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

灵芝样品多糖含量的测定：精密量取灵芝多糖溶液1 mL，置于20 mL具塞试管中，迅速精密加入硫酸蒽酮溶液6 mL，在625 nm波长处测定吸光度，按照标准曲线回归方程计算灵芝多糖样品中多糖的含量。按干燥品计算，灵芝多糖含量以无水葡萄糖（C6H12O6）计。

1.3.2 灵芝多糖分子量测定

采用凝胶渗透色谱法（Gel Permeation Chromatography，GPC）测定多糖分子量。色谱条件如下：色谱仪：Agilent 1200；检测器：示差折光检测器；色谱柱：Agilent PL aquageL-OH MIXED-M、300 nm×8 μm；流动相：0.1 mol·L-1的硝酸钠溶液；流速：1.0 mL·min-1；柱温：30℃；进样量：20 μL。

标准曲线的制作与样品测定：将分子量分别为180 Da、9 kDa、30 kDa、300 kDa、2 000 kDa 的Dextran标准品用0.1 mol·L-1的硝酸钠水溶液溶解，灵芝多糖用蒸馏水溶解（浓度为0.5 mg·mL-1），过0.22 μm的滤膜[12]，依次进样。以保留时间为横坐标，标准品的相对分子质量对数（lgMw）为纵坐标，绘制标准曲线，根据标准曲线计算灵芝多糖样品分子量。

1.3.3 灵芝多糖的单糖组成测定

灵芝多糖的水解：分别称取干燥后灵芝多糖样品各 10 mg，加入 2 mL浓度 2 mol·L-1三氟乙酸（TFA）于10 mL消解管中，拧紧管口，置于105℃的烘箱中反应6 h，拧开管口，烘干，向消解管中加入500 μL无水甲醇，再次烘干，重复3次，使残留的TFA挥发，加入3 mL去离子水复溶。

单糖衍生化：取1 mL的单糖标准溶液（0.1 mol·L-1）或多糖水解液，置于10 mL离心管中，依次加入 0.3 mol·L-1的 NaOH 溶液 600 μL，0.5 mol·L-1的PMP甲醇溶液600 μL，使用涡漩振荡器混匀，70℃水浴条件下反应2 h（期间每隔15 min振荡混匀1次），反应结束后取出，冷却至室温。加入0.3 mol·L-1的HCl溶液600 μL，混匀中和反应体系，再加入1 mL的三氯甲烷溶液充分振荡，静置，弃下层有机相，重复萃取5次，取上层水相，过0.22 μm的滤膜，进行HPLC检测[13-14]，色谱条件为：色谱仪：岛津LC-20A高效液相色谱仪；检测器：紫外检测器；检测波长：250 nm；流动相：20 mmol·L-1磷酸缓冲溶液（pH 6.7）-乙腈=82:18；流速：1 mL·min-1；色谱柱：C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱温：30℃；进样量：20 μL。

1.4 数据统计分析

采用SPSS Statistics 22进行单因素方差分析，并采用LSD法进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 不同栽培方式灵芝多糖含量

灵芝多糖含量测定结果如图1所示。

图1 不同栽培方式灵芝多糖含量Fig.1 The polysaccharides content of Ganoderma lucidum by different cultivation methods

不同栽培方式灵芝多糖含量由高到低依次为大段木灵芝>小段木灵芝>袋料灵芝，多糖含量分别为14.67 mg·g-1，11.96 mg·g-1，5.35 mg·g-1，通过 SPSS统计分析可得，3种栽培方式灵芝多糖含量之间存在极显著的差异（P<0.01）。袁学军等[15]研究了不同栽培方式对灵芝活性成分的影响，显示椰糠栽培的灵芝多糖含量最高，仿野生栽培的其次，表明灵芝多糖的含量与栽培基质有直接关系。闫梅霞[16]测定了吉林地区不同基质（木屑和段木）栽培的松杉灵芝多糖含量，结果表明段木基质大棚下栽培的灵芝多糖含量较高。灵芝多糖是灵芝重要的活性成分，其含量是判断灵芝质量高低的指标。本文的研究也表明大段木栽培灵芝多糖含量最高。

2.2 不同栽培方式灵芝多糖分子量

不同栽培方式灵芝多糖的分子量和组分含量存在差异，如表1所示。

表1 不同栽培方式灵芝多糖分子量Tab.1 Molecular weight of Ganoderma lucidum polysaccharides by different cultivation methods

大段木灵芝多糖组分不均一，2个组分的分子量为4 688 kDa和10 kDa，峰面积占比分别为88.5%和11.5%；小段木灵芝多糖组分不均一，主要多糖组分分子量为2 462 kDa，峰面积占比为85.6%，次要多糖组分分子量约为7 kDa；袋料灵芝多糖组分均一，分子量为105 kDa。研究显示灵芝多糖具有抗肿瘤等药理活性，Zhang等[17]从灵芝中分离纯化出1种灵芝多糖GLIS（分子量为2 000 kDa左右），试验证明该灵芝多糖能选择性刺激B细胞，增强免疫球蛋白的产生，还可以刺激小鼠的巨噬细胞分泌活性物质[18]，具有增强机体免疫力和抗肿瘤的药理活性。本研究从大段木灵芝中提取的灵芝多糖分子量较大，推测其可能具有相应的药理活性。

2.3 不同栽培方式单糖组成

不同栽培方式灵芝多糖的单糖种类和比例存在差异，如图2所示。

从图2和表2看出，大段木灵芝多糖主要由葡萄糖、木糖、岩藻糖、半乳糖、阿拉伯糖、核糖、鼠李糖和甘露糖8种单糖组成，其摩尔比为19.62∶3.80∶3.00∶1.95∶1.83∶1.07∶1.06∶1.00，其中葡萄糖为主要成分，含量为58.87%；小段木灵芝多糖含有5种单糖，阿拉伯糖含量（28.75%）最高，其次是木糖（23.59%）和鼠李糖（21.80%）；袋料灵芝多糖由7种单糖组成，其中葡萄糖的含量最高，半乳糖和阿拉伯糖的含量也较高。

前期研究表明，木糖有助于提高多糖的抗氧化活性[19]，王海燕等[20]从赤灵芝子实体提取多糖经分离纯化得到3个多糖级分GLMP1（462 kDa）、GLMP2（65 kDa）和GLMP3（6 kDa），多糖的单糖摩尔比各异，其中分子最大的GLMP1中单糖组成种类更多，试验表明高生物活性的木糖含量越高，相关的抗氧化活性也越高。本研究中3种栽培方式中大段木栽培灵芝多糖的单糖组成种类最多，木糖含量较高，推测其可能具有更高的生理活性。

图2 不同栽培方式灵芝多糖单糖组成HPLC色谱图Fig.2 Monosaccharide composition of Ganoderma lucidum polysaccharides from different cultivation methods by HPLC chromatogram

表2 不同栽培方式灵芝多糖的单糖组成Tab.2 Monosaccharide composition of Ganoderma lucidum polysaccharides by different cultivation methods

3 结论

本试验研究表明不同栽培方式灵芝多糖的含量、分子量和单糖组成存在差异。大段木灵芝多糖含量最高，为14.67 mg·g-1。大段木栽培灵芝含有2个不同分子量段的多糖，分子量最高达4 688 kDa，小段木灵芝多糖主要成分分子量为2 462 kDa，袋料灵芝多糖分子量为105 kDa。单糖组成方面，大段木灵芝多糖含8种单糖，葡萄糖、木糖和岩藻糖的含量较高，与甘露糖的摩尔比为 19.62∶3.80∶3.00∶1.00，小段木灵芝多糖含5种单糖，袋料灵芝多糖含7种单糖。综合各方面，本试验研究显示大段木栽培灵芝的多糖含量最高，分子量最高，单糖组成更丰富，推测其可能具有更高的生理活性，为不同栽培方式灵芝多糖的选择和应用提供了基础。

参考文献：

[1]林志彬.灵芝的现代研究：3版（精）[M].北京：北大医出版社，2007.

[2]Wasser S.Medicinal mushrooms as a source of antitumor and immune modulating polysaccharides[J].Applied Microbiology&Biotechnology,2002,60(3):258-274.

[3]Wang SY,Hsu ML,Hsu HC,et al.The anti-tumor effect of Ganoderma lucidum is mediated by cytokines released from activated macrophages and T lymphocytes[J].International Journal of Cancer,1997,70(6):699.

[4]Seto SW,Lam TY,Tam HL,et al.Novel hypoglycemic effects of Ganoderma lucidum water-extract in obese/diabetic (+db/+db)mice[J].Phytomedicine,2009,16(5):426-436.

[5]Ferreira IC,Heleno SA,Reis FS,et al.Chemical features of Ganoderma polysaccharides with antioxidant,antitumor and antimicrobial activities[J].Phytochemistry,2015(114)：38-55.

[6]张晓云，李朝谦，杨春清.不同生长期赤灵芝子实体多糖含量变化研究[J].食用菌，2008，30（1）：10-11.

[7]黄生权.赤灵芝多糖的提取分离、结构分析与生物活性研究[D].广州：华南理工大学，2010.

[8]倪力军，王媛媛，何婉瑛，等.8种多糖的单糖组成、活性及其相关性分析[J].天津大学学报：自然科学与工程技术版，2014，47（4）：326-330.

[9]徐雪峰，李桂娟，闫浩，等.赤灵芝多糖分离纯化及体外抗氧化性研究[J].食品与机械，2017，33（1）：143-147.

[10]蔡衍山，黄秀治.灵芝段木栽培技术 [J].中国食用菌，1991，10 （2）：29-31.

[11]中华人民共和国药典委员会.中华人民共和国药典：一部[M].北京：化学工业出版社，2015.

[12]耿安静，陈健，徐晓飞.GPC法测定香菇多糖的含量及相对分子质量[J].现代食品科技，2009，25（4）：458-460.

[13]万强，吴学昊，范华均，等.HPLC衍生化法分析决明子多糖水解产物中单糖组分及其多糖组成特征的研究[J].分析测试学报，2014，33（11）：1231-1236.

[14]杨兴斌，赵燕，周四元，等.柱前衍生化高效液相色谱法分析当归多糖的单糖组成[J].分析化学，2005，33（9）：1287-1290.

[15]袁学军，陈永敢，陈光宙，等.不同栽培方式对灵芝活性成分的影响[J].中国食用菌，2012，31（5）：18-19.

[16]闫梅霞，郑斯文，张瑞，等.松杉灵芝多糖含量测定[J].特产研究，2017，39（3）：39-42.

[17]Zhang J,Tang Q,Zimmerman-Kordmann M,et al.Activation of B lymphocytes by GLIS,a bioactive proteoglycan from Ganoderma lucidum[J].Life Sciences,2002,71(6):623-638.

[18]唐庆九,张劲松,潘迎捷,等.灵芝活性多糖GLIS对正常和荷瘤小鼠骨髓巨噬细胞的激活作用[J].现代免疫学,2005,25(1)：49-52.

[19]王海燕，戴军，陈尚卫.灵芝菌丝体多糖的分离纯化及其单糖组成分析与分子量测定 [J].食品与机械，2015，31（5）：201-205.

[20]Wang J,Guo H,Zhang J,et al.Sulfated modification,characterization and structure-antioxidantrelationships of Artemisia sphaerocephala,polysaccharides[J].Carbohydrate Polymers,2010,81(4):897-905.