浓香型大曲中4-乙基愈创木酚产生菌的筛选及其鉴定

王少磊，曹荣升，沈 芳，项兴本，颜守保

（安徽迎驾贡酒股份有限公司，安徽霍山237200）

中国白酒是世界六大蒸馏酒之一，其中以浓香型白酒为主，浓香型白酒产量占全国白酒行业总产量的70%以上[1-3]。浓香型白酒香味成分复杂、多样，其主体香味成分为醇类、酯类、酸类、醛类、酮类，此外，愈创木酚类、呋喃类、芳香族类以及吡嗪类化合物也为浓香型白酒的复合香气作出了重要贡献[4-5]。4-乙基愈创木酚(4-ethyl guaiacol,简称4-EG)是愈创木酚类的一种，又名4-乙基-2-甲氧基苯酚(4-ethyl-2-methoxy-pheno1)，分子式为 C9H12O2，为无色或淡黄色油状液体，呈发酵香气，略带甜味，微带酚的气息。4-乙基愈创木酚是一种天然呈香化合物，对白酒香气具有重要的贡献，它是自由基清除剂，具有良好的活性氧消除功能，可抗氧化和预防心血管等多种疾病的发生，具有预防疾病、抗衰老、促进人体健康的作用[6-8]。通常通过以下3种方法制备4-乙基愈创木酚，一是从天然木油中精馏，二是由愈创木酚或香荚兰乙酮人工合成，三是通过生物转化，其中精馏提取操作复杂，成本高；人工合成所需要的反应条件比较苛刻，且因需要剧毒的锌汞参与反应，难以工业化；而生物转化法具有周期短、反应条件温和、价格低廉、无污染、生产成本低等优点，已引起各国研究者的高度关注[9-10]。在中国白酒中，4-乙基愈创木酚是呈香组分，而微生物的生物转化是其重要的来源之一，因此本实验从浓香型白酒大曲中筛选分离获得1株4-乙基愈创木酚产生菌株，根据分离菌株生理生化、形态的研究并结合16S rDNA序列分析鉴定其种属关系，为白酒行业中4-乙基愈创木酚的生物合成提供了参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

样品：大曲样品由安徽迎驾贡酒股份有限公司提供。

试剂：2-辛醇、4-乙基愈创木酚均为标准物质，购自德国Dr.E公司；其他试剂均为分析纯或生化试剂。

仪器及设备：灭菌锅、生化培养箱、气相色谱-质谱联用仪(安捷伦7890A-5975C)/高速离心机等。

1.2 培养基

(1)平板分离培养基。LB培养基的配制(1 L)：称取胰蛋白胨10 g，NaCl 10 g，酵母提取物5 g，琼脂20 g，溶于1000 mL蒸馏水中，调 pH7.2～7.4，120℃灭菌30 min。

(2)种子液培养基。LB培养基的配制(1 L)：称取胰蛋白胨10 g，NaCl 10 g，酵母提取物5 g，溶于1000 mL蒸馏水中，调节pH 7.2～7.4，120℃灭菌30 min。

(3)发酵培养基。麸皮培养基(250 mL三角瓶)：麸皮5 g，加水95 mL，混匀分装后，以115℃湿热灭菌20 min。

1.3 培养条件

种子液培养条件：从新鲜斜面上挑取数环菌落至LB培养基中（每250 mL摇瓶装100 mL培养基），于37 ℃、160 r/min下培养24 h。

发酵培养条件：将培养好的种子液，按5%的接种量（v/m）接入麸皮培养基(每250 mL摇瓶装100 g培养基)中，于37℃、160 r/min条件下培养。

1.4 产4-EG菌株筛选方法

1.4.1 产4-EG菌株的筛选

称取5 g大曲，研磨成粉末，加入装有95 mL无菌水的250 mL三角瓶中，振荡打散后，再将获得的悬液按10倍梯度稀释到10-6，取各稀释液0.1 mL，分别涂布LB培养基平板，37℃培养24 h。挑取单菌落经划线分离为纯菌落，接种于LB培养基琼脂斜面，37℃培养24 h后4℃保藏备用。

1.4.2 产4-EG菌株的复筛

分离菌株经活化后，分别接入发酵培养基中，振荡培养(37℃、160 r/min)6 d后，过滤发酵液，以2-辛醇作为内标，4-EG为外标，通过GC-MS检测挥发组分中4-EG含量。

1.5 菌株鉴定的形态特征与鉴定

1.5.1 菌株的形态特征

(1)对分离到的菌株进行革兰氏染色，观察菌体在固体平板上的形态、颜色、黏稠度、光泽度、菌落边缘隆起情况、菌落的透明度等菌落特征，并在电子显微镜下观察菌体的显微形态。

(2)将培养过夜的菌液涂布于无菌一次性塑料平板上，在无菌工作台上自然晾干后，用无菌手术刀将平板切成1 cm×1 cm的小方块，用1%戊二醛于4℃冰箱中固定1 h，用磷酸缓冲液（PBS）冲洗2次，于4℃冰箱中，依次用10%、30%、50%、70%、90%和100%的乙醇脱水各5 min，最后自然干燥。将所制样品放置于铜片上，于SPI-Module control设备中镀金，然后将样品放于扫描电镜样品室中抽真空，扫描成像。

1.5.2 菌株的部分生理生化特性鉴定

根据《伯杰氏细菌鉴定手册》第九版[11]及《常见细菌系统鉴定手册》[12]对分离得到的菌株进行了一系列生理生化鉴定实验，包括接触酶、氧化酶、葡萄糖氧化发酵、蔗糖发酵、木糖发酵、乳糖发酵、半乳糖、吲哚试验、甲基红试验、V-P试验、硫化氢试验、尿素水解试验、柠檬酸盐利用、苯丙氨酸脱氨酶、淀粉水解、脂肪水解和明胶水解等。

1.5.3 菌株的分子生物学鉴定

(1)目标菌株的基因组总DNA提取

菌体制备和裂解：2 mL新鲜菌体培养液，12000 r/min、4 ℃离心5 min，1 mL TE重悬，洗涤并离心；加溶菌酶至100 μg/mL终浓度，37℃下保持1 h至溶液变清；加10%SDS至2%终浓度，加蛋白酶K至100 μg/mL终浓度，50℃下保持3 h。

DNA抽提：加1/3体积的饱和NaCl，剧烈振荡15 s，以4 ℃、12000 r/min 离心10 min，取上清液转入5 mL离心管中；用等体积的酚、氯仿、异戊醇抽提2次，再用氯仿抽提2次，取上清液。

DNA沉淀：上清液加入等体积异戊醇沉淀DNA，室温放置30 min后，12000 r/min离心15 min，取下层沉淀，用70%vol乙醇洗涤3次，晾干加30～50 μL双蒸水或TE，-20℃保存备用。

(2)目标菌株的16S rDNA序列PCR扩增

16S rDNA序列分析法是目前细菌种属鉴定中常用的快速分子生物学方法，采用16S rDNA扩增通用引物，以目标菌株的基因组DNA为模板，进行PCR扩增。

引物27F(5'-AGAGTTTGATCC/ATGGCTCAG-3'),1541R(5'-AAGGAGGTGATCCAGCC-3')，上海生工生物公司合成。

PCR反应体系（25 μL）：

10×Taq buffer 2.5 μL，MgCl2(25 mmol/L)2 μL，10 mM dNTPs(2.5 mmol/L)1 μL，primer(10 mmol/L）各2.5 μL，Taq polymerase 0.5 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O 13 μL。

PCR反应条件：

（3）目标菌株系统发育树的构建

16S rDNA测序由上海生物工程技术有限公司完成，测序结果采用Chromas参照正反序列图谱人工校对。校正后的16S rDNA序列在GenBank数据库中进行同源序列BLAST比对。采用Clustal X1.8对从GenBank数据库中下载的模式菌株以及试验菌株序列进行比对(Aligment)后，采用BioEdit手工删除两端不齐序列，再用MEGA 5.0构建系统发育树，并进行1000次bootstraps检验计算支持率。

1.6 4-EG分析方法

(1)气相色谱-质谱（GC-MS）分析条件

气相色谱条件：DB-WAX色谱柱(30m×0.25mm×0.25 μm)；进样口温度280℃；程序升温：初始柱温65℃，保持3 min，以5℃/min升温至150℃，保持2 min，再以10℃/min升温至280℃，保持4 min；载气：氦气（纯度≥99.999%），流速0.8 mL/min；进样方式：分流进样，分流比20∶1；进样量：1 μL。

质谱条件：电离方式：EI；监测方式：全扫描模式，质量范围45～600 amu；电离能量：70 eV；离子源温度：230℃；四级杆温度：150℃；溶剂延迟：3 min。

(2)定量分析

以2-辛醇为内标，4-EG为外标，将样品中4-EG的峰面积与内标2-辛醇的峰面积之比，和标准品中4-EG的峰面积与内标2-辛醇的峰面积之比相互比较，计算出样品中4-EG的含量。

2 结果与讨论

2.1 4-EG产生菌株的筛选

将大曲样品经过多次稀释和划线分离，根据平板上菌落的形态、颜色、黏稠度、光泽度、菌落边缘隆起情况、菌落的透明度等菌落特征，初步筛选分离获得16株菌株，从形态上判断均为细菌，分别将这些菌株进行产4-EG试验。利用GC-MS检测发酵产物中挥发性组分，以挥发性组分中的4-EG含量为基准，经过筛选获得1株4-EG产量较高的菌株(见表1)，该菌株(EG06)4-EG产生量可达32.89 μg/g发酵产物。因此，选取该菌株作进一步的菌种鉴定。

表1 产4-EG菌株的初筛结果

2.2 菌株EG06的鉴定

2.2.1 菌株EG06的形态学特征和部分生理生化鉴定

菌株EG06革兰氏染色阳性，在平板上菌落呈圆形，中央隆起，表面光滑细密，中等湿度，边缘整齐，乳白色不透明，不产生色素(见图1A)。液体培养基中无菌膜,菌液浑浊,有沉淀产生。在电子显微镜下，细胞为杆状，菌体直径为1.5～2.3 μm。单一、成对或形成小丛集(见图1B)。

菌株EG06能够在10～45 ℃，pH3～8，NaCl小于8%的条件下生长。发酵葡萄糖、蔗糖、乳糖、半乳糖，但不能发酵木糖。氧化酶试验、接触酶试验、柠檬酸盐利用试验、淀粉水解试验和脂肪水解试验为阳性；苯丙氨酸脱氢酶试验、吲哚试验、甲基红试验、V-P试验、硫化氢试验、明胶液化试验和尿素水解试验阴性。依据《伯杰氏细菌鉴定手册》，发现菌株EG06有芽孢杆菌属的典型特征，因而可以初步确定为芽孢杆菌，还需要进一步的分子生物学鉴定。

2.2.2 菌株EG06的分子生物学鉴定

获得EG06基因组总DNA后，以总DNA为模板，引物为16S rRNA通用引物，进行PCR扩增16S rRNA部分序列。扩增后得到大约1700 bp目的片段(见图2)。

图2 菌株EG06的16S rRNA PCR产物电泳图

利用16S rDNA通用引物测序，结果表明菌株EG06的16S rDNA目的片段核苷酸序列全长约1578 bp。采用NCBI提供的BLAST程序将该序列与Genebank中已注册的16S rRNA基因序列进行同源性比对，结果显示，该菌株与芽孢杆菌属(Bacillus sp.)的几个种之间同源性均达到98%。因此，可以判断该菌株属于芽孢杆菌属。

采用ClustalX1.8对GenBank中的已知序列以及测得的序列进行比对后，采用BioEdit手动删除两端不齐序列，再用MEGA5.0采用最大简约法构建系统发育树(见图3)。系统发育树分析表明菌株EG06与芽孢杆菌属多株菌株的进化亲缘关系很近，并且Bootstrap检验也达到了100%，因此，结合EG06的形态学和生理生化特征，该菌株应是芽孢杆菌属中的一个种，为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，命名为Bacillus amyloliquefaciens EG06。

2.3 代谢产物分析

将菌株Bacillus amyloliquefaciens EG06接入发酵培养基中，37℃、160 r/min培养6 d后过滤发酵液，以2-辛醇作为内标，通过GC-MS检测发酵液中挥发性组分并对其半定量。发酵上清液经GCMS检测，检测出23种挥发性组分，如亚麻酸乙酯、2，3-丁二醇、异丁酸、异辛酸、4-EG、1-石竹烯、油酸乙酯等(见图4)。其中，酯类占16.4%，醇类占35.4%，烷烃类占3.7%，酸类占25.3%，酚类物质占19.2%。这23种挥发性组分中4-EG所占总峰比例最高，为14.2%。

3 结论

4-乙基愈创木酚是一种天然呈香化合物，对白酒香气具有重要的贡献，目前国内研究较少，国外报道较多。本研究从浓香型大曲中分离出1株具有较高4-EG产生能力的菌株，4-EG产量可达32.89 μg/g发酵产物，编号为EG06。通过对其菌落及菌体形态进行观察、生理生化实验、16S rDNA序列分析，鉴定该菌株为Bacillus amyloliquefaciens。

图3 菌株EG06的16S rDNA系统发育树及分类地位，Bootstrap检测大于50%的被标明在分枝上

图4 菌株EG06发酵液挥发性组分的总离子色谱图

[1]袁先铃,黄丹,彭建.浓香型大曲中优势蛋白酶产生细菌的分离及产酶条件研究[J].酿酒科技,2012(8)：54-57.

[2]游玲,颜胜涛,王涛,等.复合菌在浓香型白酒丢糟处理中的应用[J].微生物学通报,2014,41(8)：1525-1531.

[3]郎召伟.泸型酒酿造过程中风味物质变化分析[D].无锡：江南大学,2015.

[4]王涛,游玲,赵东,等.浓香型白酒酿造相关放线菌挥发性产物分析[J].食品科学,2012,33(14)：184-187.

[5]胡沂淮,蔡楠,戴源,等.浓香型白酒堆积发酵酒醅挥发性成分分析[J].酿酒科技,2014(3)：93-96.

[6]张金修,李静,郭芳文.白酒中微量成分对人体的作用[J].酿酒科技,2014(10)：143.

[7]周金虎,管健,魏浩林,等.白酒中健康因子的研究进展[J].酿酒科技,2017(7)：90-94.

[8]陈双,陈华蓉,吴群,等.应用顶空固相微萃取-气相色谱质谱技术解析酿造用高粱蒸煮挥发性香气成分[J].食品与发酵工业,2017,43(4)：201-207.

[9]陈恩治,金涛.4-乙基愈创木酚的合成[J].香料香精化妆品,2010(3)：30-32.

[10]鲁伶兰,马锦明,张书明.4-乙基愈创木酚的合成研究[J].天津化工,2000(6)：27-28.

[11]JOHN G H,NOBEL R K,PETER H A.Bergey’s manual of determinative bacteriology[M].9th ed.Baltimore:Williams and Wilkins Press,1994.

[12]东秀珠,蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京：科学出版社,2001.