Shh基因在NIPBL+/-胎鼠肢芽内的表达*

王 莉，潘金勇，嵇继宇，张惠荣（石河子大学医学院第一附属医院儿科，新疆石河子832000）

Cornelia de Lange综合征（CdLS）是一种罕见的先天性疾病，患病率为1/100 000～1/10 000[1]。临床表现主要为严重的生长发育迟缓、智力障碍、畸形等[2]。CdLS的患者约60%是NIPBL基因发生了病理性变化[3]。有研究表明，NIPBL基因水平的高低与CdLS的严重程度密切相关[4]。Shh基因是由ZRS增强子调控参与肢芽的发育[5]，Shh基因在由ZRS增强子调控的胚胎极化活性区（ZPA）进行肢芽的表达[6]。然而，在小鼠胚胎发育阶段的肢芽中，NIPBL基因对位于ZPA区域的Shh基因具有调控作用，会影响Shh基因的表达。但2个基因之间

的具体交互作用及规律鲜见文献报道。本研究采用NIPBL-Loxp小鼠与Cre小鼠杂交，建造NIPBL+/-小鼠模型，探讨NIPBL对Shh基因表达的影响，为CdLS的诊断和干预提供新的策略。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 NIPBL-Loxp小鼠与Cre小鼠的背景品系小鼠是C57BL/6J，SPF级，购于浙江大学，全部小鼠饲养于石河子大学药学院实验动物中心。实验过程遵照石河子大学《动物实验伦理委员会管理条例》。挑选NIPBL+/-小鼠雄性体重35 g左右，雌性体重30 g左右，晚上20：00将雌雄小鼠按2∶1合笼，次日早晨8：00检查雌鼠的阴栓，阴栓阳性者将次日12：00作为其胚胎E0.5天。

1.1.2 仪器与试剂 逆转录试剂盒Prime Script RT reagent Kit购于Thermo公司；总RNA提取剂Trizol Reagent购于Life公司；逆转录试剂盒RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit购于Thermo公司；荧光定量试剂盒SYBR Green PCR Kit购于Thermo公司；普通聚合酶链反应（PCR）仪器购于TaKaRa公司；荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）仪器购于Life公司。

1.2 方法

1.2.1 动物模型的建立和实验分组 采用NIPBL-Loxp小鼠与Cre小鼠建造NIPBL+/-小鼠模型，NIPBL+/-小鼠与NIPBL+/-小鼠按照雌、雄2∶1合笼进行杂交，分别在孕鼠的E10、E11、E12天取出孕鼠放在超净台内，以颈部脱臼法处死孕鼠，在严格无菌操作条件下，分别在孕鼠的E10、E11、E12天用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）逆转录试剂盒鉴定得到6只NIPBL+/-胎鼠的肢芽作为实验组，另选取6只NIPBL+/+胎鼠的肢芽作为对照组，引物设计见表1；最后分离胎鼠双侧四肢，放入液氮15～20 min，再放入-80℃冰箱，以备后期实验。

表1 NIPBL-Loxp小鼠与Cre小鼠引物信息

1.2.2 采用qRT-PCR检测Shh基因的表达情况 Shh基因引物的设计见表2。

表2 Shh基因和β-actin的引物信息

1.2.3 实验组和对照组RNA的提取 按照RNA提取试剂盒说明书提取总RNA。

1.2.4 实验组和对照组cDNA的合成 按照逆转录试剂盒说明书对上述提取的总RNA进行逆转录。

1.2.5 qRT-PCR检测实验组和对照组Shh基因的表达情况 以上述cDNA为模板，按照荧光定量试剂盒说明书检测实验组和对照组Shh基因的表达量。

1.3 统计学处理 采用SPSS17.0统计软件进行数据处理。符合正态分布的计量资料以±s表示，对数据进行方差齐性检验，方差不齐计量资料的多组间比较采用非参数检验，组间比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 NIPBL基因敲除小鼠模型的验证 NIPBL基因敲除打靶载体构建策略图，见图1。

图1 野生型及突变型等位基因示意图

2.2 NIPBL-Loxp和Cre小鼠的引物鉴定结果 NIPBLLoxp和Cre小鼠建造的NIPBL+/-小鼠模型亲代鼠，经RT-PCR技术鉴定出在孕鼠E10、E11、E12天的NIPBL+/-和NIPBL+/+胎鼠，经鉴定出来的引物凝胶电泳结果见图 2～4。

图2 NIPBL-Loxp-F/NIPBL-Loxp-R凝胶电泳结果

图3 Cre-WT-F/Cre-WT-R凝胶电泳结果

图4 Cre-WT-F/Cre-Mut-R凝胶电泳结果

2.3 qRT-PCR验证结果 实验组和对照组胎鼠肢芽内的Shh基因在E10、11、12天均有表达，实验组和对照组胎鼠肢芽内Shh基因的ΔCt值由大到小依次为E10、E12、E11 天，表明在不同的孕期（E10、E11、E12天）时，实验组和对照组胎鼠肢芽内Shh基因表达趋势均为先升后降，即表示实验组与对照组胎鼠肢芽的Shh基因表达量在E10天时有表达，E11天时达顶峰，E12天时表达量下降，但仍高于E10天表达量。实验组在E10、E11、E12天Shh基因的表达量比较，差异有统计学意义（P＜0.01)。与对照组比较，在相同的孕期（E10、E11、E12天）内，实验组Shh基因的ΔCt值大于对照组，表明实验组胎鼠肢芽内Shh基因的表达水平低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.01)，见表3。

表3 实验组与对照组Shh基因ΔCt值的比较（±s）

表3 实验组与对照组Shh基因ΔCt值的比较（±s）

注：-表示无此项

组别对照组实验组t P n6 6- -E10天12.448 00±0.006 34 13.056 00±0.015 50-89.149 0.001 E11天9.190 00±0.002 89 10.105 00±0.005 97-337.950 0.001 E12天10.131 00±0.003 43 12.138 00±0.043 30-113.345 0.001

3 讨 论

CdLS是一种多系统发育障碍性的常染色体显性遗传疾病[7]。生长发育迟缓、面部畸形和智力障碍等是CdLS的表型特征，其中生长发育迟缓是CdLS的重要表现[8]。有关研究报道，CdLS受多种基因及信号通路的调控，一旦这些基因及信号通路发生改变，都可能导致CdLS的发生。其中，NIPBL基因缺陷是导致CdLS最常见的原因，研究人员利用分子遗传工具创建了NIPBL基因敲除小鼠，试图了解CdLS的病因学[9]。有关研究报道，Hedgehog信号通路抑制剂限制了骨骼的发育成熟，其包括 Sonic hedgehog（Shh）、Desert hedgehog（Dhh）及Indian hedgehog（Ihh）3 个配体，其中最常见的是 Shh[10]。Shh基因编码一种信号蛋白，在小鼠胚胎肢芽的发育过程中起不可或缺的作用[11]。Shh基因编码的Shh蛋白是与ZPA极化功能有关的一种形态发生素，由ZPA中细胞产生，ZPA区域传递肢芽早期的发育信号，启动Shh基因的表达[12]。有研究表明，小鼠胚胎肢芽中Shh蛋白的变化存在于肢体发育前10 h，且Shh蛋白量的改变会影响肢体缺陷的程度[13]。相关研究显示，NIPBL在ZPA区域和肢芽的间充质细胞对Shh基因进行调控，一旦NIPBL基因缺陷，会引起Shh基因表达的信号通路受到抑制，造成Shh基因的表达缺失，引起ZPA区域染色体位点异常，从而形成了CdLS的特征性改变[14]。因此，本研究通过建立NIPBL基因敲除模型，进一步研究NIPBL和Shh2个基因之间的相互作用机制。

有研究报道，Shh基因通常在正常胎鼠肢芽的E9.5～E11.5天进行表达，且在孕鼠的E10天左右表达量逐渐增多，在E11天大量表达，在E12天左右表达量逐渐减少[15]。本实验观察到胎鼠在E9.5天时仍是个椭球形，很难分辨出胚胎的器官，Shh基因也几乎检测不出表达；E12.5天时，胎鼠的肢芽也几乎检测不到Shh基因的表达。因此，本实验选取胎鼠的E10、E11、E12天作为实验分组。本实验结果表明，在孕鼠的E10、E11、E12天，实验组和对照组的胎鼠肢芽内均有Shh基因的表达，但是实验组胎鼠肢芽内Shh基因的ΔCt值大于对照组，表明实验组胎鼠肢芽内Shh基因的表达水平低于对照组（ΔCt值越高，Shh基因的表达水平越低），说明NIPBL基因缺陷影响胎鼠肢芽内Shh基因表达的正常信号通路，抑制了Shh基因的表达。实验组和对照组胎鼠肢芽内Shh基因ΔCt值大小依次为E10、E12、E11天，表明在不同的孕期（E10、E11、E12天）内，实验组和对照组胎鼠肢芽内Shh基因的表达趋势是E10天时有表达，但表达量较少，随后表达量逐渐增多，在E11天时达到顶峰，随后表达量逐渐减少，E12天表达量较E11天减少，但比E10天表达量增多，差异有统计学意义（P＜0.01）。

综上所述，NIPBL+/-基因敲除抑制胎鼠肢芽内Shh基因的表达，而Shh基因在体内正常的软骨发育中起重要调控作用，由此推断NIPBL+/-基因敲除胎鼠可能会抑制软骨的发育成熟，进一步导致CdLS。本研究有助于人们进一步了解NIPBL基因在CdLS发病中的机制和意义，并为CdLS疾病的诊断和干预提供新的策略，帮助研究人员深入了解CdLS疾病，以便探索更好的治疗方法。

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