不同干燥方式对金线莲黄酮体外活性影响的研究

刘 露，孙连立，裴运林，聂艳峰，张黎兴，龙京洲

（广东丸美生物技术股份有限公司，广东 广州 510663）

黄酮类化合物已被证实具有抗自由基［7］、抗氧化［8］、抑制络氨酸酶活性［9］、抗病毒、抗肿瘤［10］、抗心律失调、肝保护、镇痛等功效。近年来，国内外对金线莲黄酮的研究主要集中于黄酮的提取工艺［11］、黄酮苷元成分的检测［12］以及不同品种［13］、种植方式［14］对黄酮含量的影响等方面，虽也有研究不同来源方式对金线莲黄酮含量及其体外抗氧化的影响［15］，而有关不同干燥方式对金线莲黄酮体外抑制黑色素合成和酪氨酸酶活性的研究较少。因此，探讨不同干燥方式金线莲黄酮体外抗氧化及对人黑色素瘤A375细胞酪氨酸酶活性、黑色素合成的影响对于指导其进一步开发利用具有重要意义。

目前关于不同干燥方式对中草药色泽、质构和营养成分的影响研究报道较多，而关于干燥对其生物活性的影响研究较少。不同的干燥方式因温度、时间等干燥条件的不同，对黄酮的结构和活性的影响会有差异。李晓丽等［16］研究表明真空冷冻干燥后的无核紫葡萄比自然晒干、热风干燥和荫干的总黄酮含量高，抗氧化活性强。为此，本研究采用真空冷冻（FD）、和恒温鼓风干燥（AD）两种方式干燥金线莲后提取黄酮，对比鲜样，分析不同干燥方式对金线莲黄酮体外抗氧化及抑制黑色素合成、酪氨酸酶活性的影响，旨在为金线莲应用研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试金线莲购于福建漳州市溢绿农业开发有限公司；芦丁标准品，购自美国Sigma 公司，95%乙醇，甲醇、硝酸铝、亚硝酸钠、磷酸、磷酸、铁氰化钾、三氯乙酸、氯化铁等均为分析纯。

主要仪器：UV-2600紫外可见分光光度计，日本岛津有限公司；FDU-2110真空冷冻干燥仪，日本东京理化株式会社；binder FD115热泵干燥箱，宾德环境试验设备（上海）有限公司；RV10旋转蒸发仪，艾卡（广州）仪器设备有限公司（IKA 中国）; 九阳JYL-C022E料理机，九阳股份有限公司；MCO-15AC CO2培养箱，日本SANYO；HWS-24电热恒温水浴箱，上海跃进医疗器械厂；SPARK 10M多功能酶标仪，瑞士TECAN。

1.2 试验方法

1.2.1 金线莲干燥工艺 冷冻干燥工艺：鲜金线莲→清洗→料理机粉碎→冷冻干燥72 h粉→碎过孔径0.250 mm筛→ 金线莲冷冻干燥样品。

热泵干燥工艺：鲜金线莲→清洗→干净→热泵干燥72 h→粉碎过孔径0.25 mm筛→金线莲热泵干燥样品（水分含量8.75%）。

鲜样：鲜金线莲→清洗→粉碎→ 金线莲鲜样（水分含量94.96%）。

通过对国内外相关研究的梳理和研究动态分析，发现研究可以分成以下3个方面：1) 关于多模态语料库创建和应用研究；2) 关于翻译工作坊研究；3) 关于教学与实训平台创建研究.

1.2.2 金线莲总黄酮的提取及测定 称取一定量的2种干燥金线莲样品和鲜金线莲样品，在料液比1∶100，提取时间60 min，提取温度70℃，乙醇浓度为80%的条件下提取3次，合并滤液，浓缩干燥得金线莲黄酮。将冷冻干燥金线莲黄酮记为FDAF，热泵干燥金线莲黄酮记为ADAF，鲜金线莲黄酮记为FAF。金线莲总黄酮含量测定采用比色法［17］。

1.2.3 不同干燥方式金线莲黄酮的体外抗氧化活性 不同干燥方式金线莲黄酮的DPPH自由基清除能力：称取一定量金线莲黄酮样品配制成一定浓度溶液，在2 mL样品溶液中加入2 mL用乙醇配制的0.8 mmol/mL DPPH溶液，混匀后置暗室中静置30 min，于波长517 nm 处测定吸光度。计算DPPH 清除率：

式中，Ax为加入样品溶液后的吸光度，Ax0为样品溶液本底的吸光度，A0为空白对照液的吸光度。

不同干燥方式金线莲黄酮的还原力：称取一定量金线莲黄酮样品配制成一定浓度溶液，在2 mL样品溶液中加入0.2 mol/L磷酸缓冲液（pH 6.6）和1%铁氰化钾溶液各2.5 mL，混合均匀，混合液50℃保温20 min 后加入2.5 mL 10%三氯乙酸，混匀，3000 r/min 离心10 min。取上清液5 mL，加5 mL 蒸馏水和1 mL 0.1%FeCl3，混合均匀，10 min后于波长700 nm 处测定吸光度。

不同干燥方式金线莲黄酮的总抗氧化力：FRAP 法测定金线莲黄酮的抗氧化活性［18］。

1.2.4 不同干燥方式金线莲黄酮对人黑色素瘤A375细胞酪氨酸酶活性以及黑色素合成的影响［19］不同干燥方式金线莲黄酮对人黑色素瘤A375细胞生长活性的影响：取对数生长期细胞接种于96孔培养板内，每孔100 μL（含1×104个细胞），置于37℃，5% CO2温箱中培养。24 h后，待细胞贴壁为 80%左右，给药组加入含有不同稀释浓度的待测样品（1 mg/mL金线莲黄酮），每种细胞设多个剂量（10倍稀释）处理，每个处理至少设3个平行孔。空白对照加入与给药处理等体积的溶剂。置于37℃，5% CO2温箱中培养。作用24 h后，弃培养液，换新鲜无血清培养基100 μL，每孔加入10 μL WST-8溶

液，37℃孵育2 h，在检测波长450 nm条件下测定光密度值（OD），根据以下公式计算人黑色素瘤A375细胞生长率：

不同干燥方式金线莲黄酮对人黑色素瘤A375细胞酪氨酸酶活性的影响：（1）选择对数生长期A375细胞，将细胞浓度调整为 1×105cells/mL，加入96孔细胞培养板，每孔100 μL；（2） 次日，待细胞贴壁后，加入上述实验得到的对人黑色素瘤A375细胞最低抑制浓度的金线莲黄酮，空白对照加入无样品培养基；（3） 继续培养48 h后，用 PBS 洗 2 遍，每孔加入1%Triton×100溶液100 μL，迅速置-80℃冻存 30 min；（4）随后室温融化使细胞完全裂解，37℃预温后加入10 g/L多巴溶液 100 μL，37℃反应0. 5 h；（5） 490 nm处测定吸光度值。每个浓度处理设3个复孔，取平均值。

不同干燥方式金线莲黄酮对人黑色素瘤A375细胞黑色素合成的影响：（1）选择对数生长期A375细胞，将细胞浓度调整为5×103个，加入24 孔细胞培养板，每孔1 mL；（2）待细胞贴壁后加入上述实验得到的对人黑色素瘤A375细胞最低抑制浓度的金线莲黄酮的培养液，每孔1 mL ，空白对照加入无样品培养基；（3）培养4 d后，0.25%胰蛋白酶消化，将细胞收集入离心管离心 10 min （1000 r/min） ，倾去上清液；（4）再用PBS洗2次后，加入1 mol/L氢氧化钠0.5 mL，在37℃作用48 h，充分裂解细胞和溶解黑色素颗粒，离心取上清；（5）每孔加入100 μL上面液体，在405 nm处测定吸光度值。每个浓度处理设3个复孔，取平均值。

1.3 数据处理和统计分析

数据分析运用SPSS18.0软件，采用ANOVA进行统计分析，各处理间的差异比较用LSD法，运用Microsoft Excel 2010软件绘制统计图表。

2 结果与分析

2.1 不同干燥方式对金线莲黄酮含量的影响

不同干燥方式对金线莲黄酮含量的影响如图1所示，与FAF对比，不同干燥方式对金线莲黄酮含量存在显著影响，FDAF中黄酮含量24.55（±0.28）mg/g显著高于ADAF（114.39±0.09 mg/g），ADAF黄酮含量比FDAF低70.56%。真空冷冻干燥具有保持原有生物活性、外观色泽及形态，残余水分低等特点，其提取得率接近于鲜样提取，是获得高品质生物制品的优良干燥方法。ADAF处理方式可能破坏掉部分黄酮分子结构，使其含量降低。

2.2 不同干燥方式金线莲黄酮的体外抗氧化活性

不同干燥方式金线莲黄酮对DPPH自由基清除率、还原力和总抗氧化能力如表1所示。DPPH 自由基是反映抗氧化活性的重要指标，与FAF相比，干燥方式制得金线莲黄酮提取物对DPPH 自由基均有一定的清除作用，且呈剂量依赖性，对DPPH自由基清除能力大小依次为：FAF＞FDAF＞ADAF，且不同干燥方式之间存在显著差异。ADAF清除自由基能力平均比FDAF（33.80%）低27.25%，FAF与FDAF对DPPH清除能力无显著差异。

在0.5～5.0 mg/mL范围内，金线莲黄酮的还原能力和总抗氧化能力与物质浓度呈正比例关系，FDAF的还原力和总抗氧化能力均显著强于ADAF。

在0.2～5.0 mg/mL范围内，金线莲黄酮的总抗氧化能力随物质浓度的增加不断增加。其中FAF和FDAF的总抗氧化能力无显著差异，ADAF的总抗氧化能力最弱，且与FAF、FDAF差异显著。

图1 不同干燥方式对金线莲黄酮含量的影响

表1 不同干燥方式金线莲黄酮的DPPH清除率、还原力和总抗氧化能力

2.3 不同干燥方式金线莲黄酮对人黑色素瘤A375细胞酪氨酸酶活性以及黑色素合成的影响

2.3.1 不同干燥方式金线莲黄酮对人黑色素瘤A375细胞生长活性的影响 不同干燥方式金线莲黄酮对人黑色素瘤A375细胞生长活性的影响如表2所示，由表2可知，金线莲黄酮在一定浓度范围内对人黑色素瘤A375细胞具有较强的抑制生长作用，表现出一定的抗肿瘤活性。其中FDAF、ADAF、FAF均在10 μg/mL时对人黑色素瘤A375细胞毒性最弱，分别为0.45%、3.75%和1.56%，有微弱的促生长作用。本实验主要探讨金线莲黄酮体外抑制酪氨酸酶及黑色素合成活性的影响，因此选择此浓度为考察不同干燥方式金线莲黄酮对人黑色素瘤A375细胞酪氨酸酶活性及黑色素合成影响的浓度。

2.3.2 不同干燥方式金线莲黄酮对人黑色素瘤A375细胞酪氨酸酶活性的影响 不同干燥方式金线莲黄酮对人黑色素瘤A375细胞酪氨酸酶活性的影响如图2所示，与对照比较，FAF、ADAF和FDAF均对人黑色素瘤A375细胞酪氨酸酶活性有抑制作用，其抑制强度依次为AFA＞FDAF＞ADAF。其中FDAF比ADAF对人黑色素瘤A375细胞酪氨酸酶活性抑制作用高11.28%。

表2 不同浓度不同干燥方式金线莲黄酮对人黑色素瘤A375细胞增殖率的影响（%）

图2 不同干燥方式金线莲黄酮对人黑色素瘤A375 细胞酪氨酸酶活性的影响

2.3.3 不同干燥方式金线莲黄酮对人黑色素瘤A375细胞黑色素合成的影响 不同干燥方式金线莲黄酮对人黑色素瘤A375细胞黑色素合成的影响如图3所示，与对照比较，FAF、ADAF和FDAF均对人黑色素瘤A375细胞黑色素合成有抑制作用，抑制活性均显著高于对照。其中ADAF抑制作用最强，高于FDAF 70.70%，这可能与ADAF中所含不同黄酮单体有关［20］。FAF与FDAF的抑制作用无显著差异。

图3 不同干燥方式金线莲黄酮对人黑色素瘤A375 细胞黑色素合成的影响

3 结论与讨论

通过不同干燥方式对金线莲黄酮含量的影响研究发现，真空冷冻干燥制的金线莲黄酮含量（24.55±0.28 mg/g）与鲜样（25.25±0.68 mg/g）无显著差异，且显著高于恒温鼓风干燥（14.39±0.09 mg/g）。真空冷冻干燥温度低，利于黄酮类化合物的保存，而恒温鼓风干燥则会在一定程度上破坏黄酮的分子结构以致其含量降低，提取率下降。此结果与孙红艳等和李翠丽等的研究结果［21-22］一致，冷冻干燥对比与恒温鼓风干燥或热风干燥有利于黄酮含量和功效成分的保留。

本实验还发现，不同干燥方式金线莲黄酮体外均具有一定抗氧化活性，且呈剂量依赖型，FDAF活性显著强于ADAF，且与FAF无显著性差异。这与刘慧娟等的研究结果［23］一致，其在研究不同干制加工方式对荷叶茶黄酮类物质含量及其抗氧化活性的影响时发现，荷叶总黄酮含量与FRAP和DPPH均为极显著相关。另也有研究表明植物提取物抗氧化活性与其总黄酮含量具有相关性［24］。

真空冷冻干燥方式金线莲黄酮对酪氨酸酶活性的抑制率显著高于恒温鼓风干燥，而抑制黑色素合成的活性显著低于ADAF。这可能与ADAF中所含黄酮单体结构有关。宋烨威［25］研究表明，从昆仑雪菊黄酮中分离出的3种活性单体化合物的体外抗氧化活性和抑制酪氨酸酶活性均不同。不同的干燥方式对金线莲黄酮的理化性质及结构产生影响，进而影响其活性，但是其内在机理尚需进一步研究。

综上所述，对比鲜样，本实验中真空冷冻干燥方式得到的金线莲黄酮体外抗氧化及抑制酪氨酸酶和黑色素合成的活性最高，这与吴琼等的研究结果［26］一致。由此可将冷冻干燥金线莲黄酮作为研究其高价值应用的手段之一。

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