广东火龙果果柄腐烂病病原菌的分离及鉴定

雷梦英，杨晓朱，李落叶，匡蓉琳，李馥纯，莫介羽，黄少彬

（广东生态工程职业学院，广东 广州 510520）

火龙果属仙人掌科（Cactaceae）量天尺属（Hylocereus）植物，原产于墨西哥、巴西、古巴、尼加拉瓜等中美洲的热带雨林和沙漠地区，后经人工栽培遍及美国南部以及越南、菲律宾、泰国等东南亚国家，在我国海南、广东、广西、贵州、福建、云南和台湾地区也有种植［1-4］。火龙果是热带水果中少有的凉性水果，富含水溶性膳食纤维、花青素、维生素等，具有抗癌和预防高血压的功效［5-6］。

火龙果高产、早产，经济价值高，是近年来新兴的热带水果之一。目前国内火龙果的主要栽培品种为红皮红肉和红皮白肉两种类型，而种植红肉品种的经济效益最佳［7-8］。随着火龙果种植面积不断扩大，其病害发生也逐渐加重。据报道，火龙果茎干病害有疮痂病、茎腐病、枯萎病、茎枯病、溃疡病、枯斑病、基腐病和病毒病等［9-11］。火龙果果实病害主要有由尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）、单隔镰刀菌（F.dimerum）、桃吉尔霉（Gilbertella persicaria）、仙人掌平脐蠕孢（Bipolaris cactivora）等引起的火龙果果实腐烂病［12-14］，以及由胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）引起的炭疽病在火龙果的茎干和果实上均可发病［15］。

我们在广东省广州市从化区一火龙果种植基地发现了一种火龙果新病害，命名为火龙果果柄腐烂病。病原菌通过危害火龙果果柄，影响其商品价值。火龙果果柄腐烂病的症状与已报道的火龙果病害症状存在明显差异，目前尚未有对该病害病原菌系统研究的报道。鉴于此，我们对该病害的病原菌进行了分离和纯化培养，根据病原菌的菌落形态、分生孢子形态特征，同时结合rDNA-ITS序列和系统发育树分析对该病原菌进行鉴定分析，明确火龙果果柄腐烂病的病原菌种类，以期为该病的防治研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试红肉火龙果于2017年7月20日购自广东省广州市从化区温泉镇一火龙果种植基地，采摘后直接运往实验室，室温存放，观察发病情况。

马铃薯葡萄糖固体培养基（PDA）：马铃薯200 g，葡萄糖 20 g，琼脂 15 g，水1000 mL；修改的Bilay培养基：磷酸二氢钾1 g，硝酸钾1 g，硫酸镁0.5 g，氯化钾0.5 g，淀粉0.2 g，葡萄糖0.2 g，蔗糖 0.2 g，琼脂 15 g，水 1000 mL。

1.2 病原菌分离

在感染腐烂病的火龙果果柄病健交界处切取大小为2～3 mm×2～3 mm的组织块。表面消毒后于70%酒精浸泡消毒1 min，无菌水冲洗1次。2%次氯酸钠溶液浸泡消毒1 min，无菌水冲洗3次，将组织块置于无菌吸水纸上晾干。将消毒处理的组织块置于PDA固体培养基上，培养基中加入终浓度为50 μL/mL的硫酸链霉素以抑制细菌生长。25℃光照和黑暗交替培养2 d后，用灭菌的接种针挑取菌落边缘菌丝转入PDA平板培养基上进行纯化培养。

1.3 病原菌单孢分离纯化

用灭菌水冲洗病原菌菌落，以两层无菌擦镜纸过滤除去菌丝，配制成浓度为1.0×104个/mL的孢子悬浮液。取10 μL孢子悬浮液均匀涂布在PDA培养基上。25℃光照和黑暗交替培养，待由单个孢子形成的菌落长出后，挑取菌落边缘菌丝转移至新的PDA培养基上纯化培养。纯化的菌株接种在PDA试管斜面上，于4℃保存备用。

1.4 病原菌的柯赫氏法则验证

将分离获得的病原菌在PDA平板上25℃光照和黑暗交替培养7 d，制备孢子悬浮液，无菌水稀释至1.0×106个/mL。将健康无伤口的火龙果在2%次氯酸钠溶液浸泡3 min，蒸馏水冲洗3次后在超净工作台上晾干。将10 μL孢子悬浮液接种于火龙果果柄处，放入塑料盒中。接种等量无菌水作为空白对照。每个处理接种10个果实。取发病的火龙果，按照1.2的方法重新分离病原菌，并与原接种病原菌进行菌落形态、颜色比较，如果重新分离获得的病原菌与原接种病原菌一致即确定其为火龙果果柄腐烂病的病原菌。

1.5 病原菌形态观察和鉴定

将保存的菌株接种到PDA平板上，25℃活化培养3 d。使用无菌手术刀在菌落边缘切取菌丝块（5 mm×5 mm），分别转接到新的PDA平板和修改的Bilay培养基平板上，25℃光照和黑暗交替培养，记录菌落的形态特征包括菌落颜色、大小等。无菌接种针挑取培养7 d的菌落，制备临时玻片观察病原菌显微特征。依据菌落培养特征，以及分生孢子形态、颜色和大小等特征，参照布斯（Booth）镰刀菌分类系统［16］对分离获得的病原菌进行形态学鉴定。

1.6 病原真菌的分子生物学鉴定及分析

利用真菌通用引物扩增病原菌基因组中的保守rDNA-ITS序列，为病原菌种类的鉴定提供分子依据。

基因组DNA提取：将病原菌菌株接种于PDA平板上，25℃光照和黑暗交替培养7 d。刮取约0.1 g菌丝体，于液氮中研磨成粉末。使用AxyPrep基因组DNA小量试剂盒提取基因组DNA。

rDNA-ITS序列扩增及分析：以提取的病原菌菌株的基因组DNA为模板，使用真菌通用引物 ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）和ITS5（5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'），按以下条件扩增其rDNA-ITS序列。50μL PCR扩增体系如下：10×PCR buffer 5 μL，2.5 mmol/L dNTP 4 μL，10 μmol/L ITS4 和 ITS5引物各 1 μL，病原菌 DNA 2 μL，5 U/μL的ExTaqDNA聚合酶0.5 μL。PCR扩增程序为：94℃预变性5 min；94℃变性40 s、56℃退火40 s、72℃延伸1 min，共35个循环；72℃再延伸10 min；4℃保存。取5 μL PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳（110 V，30 min）检测确认目的片段大小后，使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒回收纯化。回收纯化产物委托生工生物工程（上海）股份有限公司测序。采用BLAST程序将获得的测序结果在美国国家生物技术信息中心（NCBI）数据库中进行同源比对分析，对病原菌进行分子水平鉴定。从NCBI网站数据库中下载病原菌rDNA-ITS序列的同源序列及其近缘种序列。用Clustal x 2.0软件进行多重序列比对后，用Mega 7.0系统发育软件采用邻近法（neighbor-joining）构建系统发育树。依据分支的支持率，确定其系统发育关系。

2 结果与分析

2.1 症状描述

火龙果果实室温存放5 d后，其腐烂病发病最为严重。此外，还发现一种为害火龙果果柄的腐烂病（图1A，封三），命名为火龙果果柄腐烂病。该病发病率较低（5%左右），影响火龙果的外观和商品价值。其典型症状为果柄处有白色菌丝。挑取白色菌丝显微观察，发现存在少量的镰刀菌（Fusariumsp.）大型分生孢子，初步推断该病原菌为一种镰刀菌（Fusariumsp.）。

2.2 病原菌柯赫法则验证

火龙果果柄腐烂病病原菌经单孢分离，共获得纯化菌株15株（A1～A15）。除菌株A5和A12外，其他13株的菌落形态完全一致，随机选取菌株A11作为代表菌株用于后续研究。运用柯赫法则分别将菌株A5、A11和A12接种于健康火龙果的果柄处，结果发现菌株A5和A12接种7 d后，仍无明显症状。而菌株A11接种3 d后火龙果果柄处可见明显的白色菌丝，接种7 d后的症状与火龙果果柄腐烂病的症状相符合（图1B、C，封三）。从接种火龙果的发病部位分离到与菌株A11菌落培养性状、分生孢子形态一致的病原菌，符合柯赫氏法则。由此确定病变组织分离获得的这种镰刀菌是火龙果果柄腐烂病的致病病原菌。

2.3 病原菌培养性状与形态特征

病原菌菌株A11在PDA培养基上的菌落呈圆形，生长旺盛，生长速率为13.5 mm/d（图2A）。气生絮状菌丝初期呈白色，后期产生橙黄色大孢子堆。培养基平板背面颜色初期为白色，后变为黄褐色，最后变成深棕色。病原菌在修改的Bilay培养基上生长速率为18.7 mm/d（图2B），气生菌丝少，白色。大型分生孢子从瓶状小梗上产生，孢子量多。未观察到小型分生孢子。大型分生孢子镰刀状，略微向内弯曲，3～6个隔膜（多为3～5个，图2C）。根据病原菌菌落形态和大型分生孢子特征，参照布斯（Booth）镰刀菌分类系统［16］，初步鉴定火龙果果柄腐烂病原菌为木贼镰刀菌（F. equiseti）。

2.4 病原菌rDNA-ITS分子鉴定

采用rDNA-ITS分子鉴定将分离获得的病原菌鉴定到种。以分离获得的病原菌菌株A11、A13和A15的基因组DNA为模板，使用真菌通用引物ITS4和ITS5扩增获得它们的rDNAITS序列（图3）。测序结果表明病原菌菌株A11、A13和A15的rDNA-ITS序列完全一致，序列长度约为540 bp。将病原菌菌株A11序列在NCBI上进行BLAST比对，发现该病原菌菌株的rDNA-ITS序列与登录号为HM008677的木贼镰刀菌（F. equiseti）rDNA-ITS序列的同源性最高，为100%，比对覆盖率（query cover）为99%，E值为0。综合形态学鉴定结果和rDNAITS序列比对结果，最终确认引起火龙果果柄腐烂病的病原菌为木贼镰刀菌。

图2 火龙果果柄腐烂病原菌菌落特征和分生孢子形态

图3 火龙果果柄腐烂病原菌rDNA-ITS序列的PCR扩增结果

2.5 病原菌系统发育分析

基于rDNA-ITS基因的碱基序列，以链格孢菌（Alternaria alternata）的rDNA-ITS序列（FJ618522.1）为外围树根，采用邻接法（NJ）构建了8株镰刀菌属的系统发育树（图4）。发现镰刀菌属存在明显的属内遗传差异，其中引起火龙果果柄腐烂病的木贼镰刀菌与梨孢镰刀菌（F. poae）、禾谷镰刀菌（F. graminearu）和拟枝孢镰刀菌（F. sporotrichioides）的遗传关系较近，其支持率高达99%。而木贼镰刀菌与串珠镰刀菌（F. proliferatum）和茄腐镰孢菌（F.solani）的遗传关系较远。

图4 基于rDNA-ITS序列的系统发育树

3 结论与讨论

火龙果是近年发展起来的热带和亚热带水果之一，具有较高的营养价值和保健功能。火龙果高产、早产，种植技术要求不高，市场需求大且价格好，具有十分可观的发展前景［7］。但火龙果种植地区气温高，湿度大，随着火龙果种植面积的不断扩大，病害问题日益严重［9］。

镰刀菌属（Fusarium）又称镰孢菌属，普遍存在于土壤和有机体内，兼寄生或腐生生活。其中尖孢镰刀菌（F. oxysporum）和单隔镰刀菌（F. dimerum）均可引起火龙果果实腐烂病的发生［12］。镰刀菌属菌种资源繁多，形态特征复杂。本研究以传统形态学特性鉴定为基础，结合rDNA-ITS基因序列同源性分析，最终确定火龙果果柄腐烂病的病原菌为木贼镰刀菌。已有研究表明木贼镰刀菌作为弱致病菌，能侵染多种植物的种子、根系、块茎和果实，引起刚竹秆褐腐病、黄蜀葵茎枯病、辣木枝枯病、樱桃采后软腐病等，感病植株枝叶枯黄脱落，枯萎死亡［17-20］。此外，木贼镰刀菌也可与镰刀菌属等其他病原菌通过复合侵染，引起玉米穗腐病、苜蓿根腐病、向日葵枯萎病等［21-23］。

火龙果果柄腐烂病属首次发现，尽管尚未发现其对火龙果可食部分造成危害，但对火龙果外观品质存在潜在的影响。对于火龙果果柄腐烂病，除了进一步了解其发生特点和流行规律，还需要明确木贼镰刀菌的生物学特性及其对杀菌剂的敏感性，为火龙果果柄腐烂病的综合防治提供理论依据。

参考文献：

［1］ 田新民，李洪立，何云，等. 火龙果研究现状［J］. 北方园艺，2015（18）：188-193.

［2］ 郑良永，钟宁．雷州半岛火龙果高效栽培技术［J］．广东农业科学，2006（3）：76-78.

［3］ 苏明，任太军，袁水清，等. 海南火龙果反季节生产技术初探［J］. 中国南方果树，2018，47（1）：83-86

［4］ 黄艳芳，秦媛媛，阮晓静，等. 广西火龙果产业发展现状及可持续发展对策研究［J］. 热带农业科学，2017，37（6）：97-99.

［5］ 罗萍，师莉莎，刘华忠. 火龙果汁体外抗氧化能力研究［J］. 广东农业科学，2013，40（20）：93-96.

［6］ 宋燕. 火龙果果皮中可溶性膳食纤维的提取［J］. 食品与发酵工业，2013，39（12）：209-212.

［7］ 邓仁菊，范建新，蔡永强. 国内外火龙果研究进展及产业发展现状［J］. 贵州农业科学，2011，39（6）：188-192.

［8］ 刘顺枝，刘政浩，林润怡，等. 白肉火龙果染色体制片技术及核型分析［J］. 广东农业科学，2015，42（3）：115-118.

［9］ 袁诚林，张伟锋，袁红旭. 粤西地区火龙果病害调查初报及防治措施［J］. 中国南方果树，2004，33（2）：49-50.

［10］ 易润华，甘罗军，晏冬华，等. 火龙果溃疡病病原菌鉴定及生物学特性［J］. 植物保护学报，2013，40（2）：102-108.

［11］ 戴俊，王会会，符碧海，等. 火龙果溃疡病和茎腐病病原菌的生物学特性测定［J］. 中国南方果树，2017，46（1）：78-82.

［12］ 崔志婧，王奕文，于岳，等. 上海市进口火龙果软腐病病害分析［J］. 微生物学通报，2011，38（10）：1499-1506.

［13］ 刘月廉，周娟，赵志慧，等. 广东省火龙果腐烂病病原鉴定［J］. 华中农业大学学报：自然科学版，2011，30（5）：585-588.

［14］ 郭力维，吴毅歆，何汉兴，等. 云南省火龙果采后果腐病研究［J］. 果树学报，2014（1）：111-114.

［15］ Masyahit M，Sijam K，Awang Y，et al. The first report of the occurrence of anthracnose disease caused byColletotrichum gloeosporioides（Penz.）Penz. & Sacc. on dragon fruit（Hylocereusspp.）in Peninsular Malaysia［J］. American Journal of Applied Sciences，2009，6（5）：g6420-g6420.

［16］ 布斯（Booth）. 镰刀菌属［M］. 陈其煐，译. 北京：农业出版社，1988.

［17］ 周春来，吴小芹，叶利芹，等. 刚竹秆褐腐病病原形态及分子鉴定［J］. 南京林业大学学报（自然科学版），2011，35（3）：84-88.

［18］ 夏敏媛，张瑜，沈小林，等. 黄蜀葵茎枯病病原菌的分离与鉴定［J］. 中国生化药物杂志，2015，35（9）：12-14.

［19］ 康迅，靳鹏飞，冯霞，等. 辣木枝枯病病原菌鉴定及其生物学特性［J］. 植物保护学报，2017，44（3）：481-487.

［20］ Wang C，Wang Y. First report of postharvest fruit rot caused byFusarium equisetion storedCerasus pseudocerasusin China［J］. Plant Disease，2017，101（6）.

［21］ 黄思良，卢维宏，陶爱丽，等. 南阳市玉米穗腐病致病镰刀菌种群结构分析［J］. 南阳师范学院学报，2012（3）：54-57.

［22］ 魏然，郭庆元，白剑宇，等. 苜蓿根腐病多种病原菌的分子检测［J］. 新疆农业科学，2016，53（7）：1268-1275.

［23］ 高婧，张园园，王凯，等. 向日葵枯萎病菌的分离鉴定及其生物学特性［J］. 中国油料作物学报，2016，38（2）：214-222.