新型高氮无镍不锈钢与L605合金及316L不锈钢生物相容性对比研究

刘美霞，赵静，王青川，张炳春，杨柯

中国科学院 金属研究所，辽宁 沈阳 110016

引言

生物医用金属材料具有高强度、良好的韧性、良好的抗疲劳性能和优异的加工成型性，并且具有优异的抗腐蚀性能和良好的生物相容性，被广泛用于制造各类临床植入体[1]。316L不锈钢（316LSS）和钴铬合金（L605）是临床中应用最广泛的心血管支架材料，但其中都含有9wt.%以上的镍（Ni）元素。大量临床实验证明，Ni是一种潜在的致敏因子，镍离子在生物体内富集可能会诱发毒性效应，导致细胞破坏和炎症反应，对生物体有致畸、致癌的潜在危害[2-5]。因此，降低材料中Ni的含量是提高材料生物相容性的重要手段。

随着对材料中Ni的含量要求越来越严格，早在20世纪90年代国内外就已经开展了高氮无镍不锈钢的研究和开发工作。1996年Menzel等[6]对高氮无镍奥氏体钢在医疗领域中应用的可行性进行了分析，对Fe-18Cr-18Mn-2Mo-1N高氮无镍不锈钢的组织和性能进行了全面研究。同时，通过降低钢中的Cr和Mn含量，适当提高Mo含量，开发出Fe-15Cr-(10-15)Mn-4Mo-0.9N高氮无镍医用不锈钢[7]。近年来，美国、日本、加拿大等国家对高氮无镍不锈钢在骨科及心血管方面的应用也开展了相关研究[8-12]。以上研究均表明，较传统不锈钢316L SS，高氮无镍不锈钢具有更加优异的力学性能、耐蚀性能及生物相容性。在国内，中国科学院金属研究所杨柯研究员领导的生物材料课题组首次研发出一种新型高氮无镍不锈钢（High Nitrogen Nickel-Free Stainless Steel，HNNFS）心血管支架材料，目前已经取得突破性进展[13]。本文开展HNNFS与L605、316LSS的生物相容性对比研究，通过溶血及细胞增殖等实验，对3种材料的血液相容性以及对血管平滑肌细胞的增殖作用进行评价，为HNNFS在心血管支架领域的应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料制备

本实验将HNNFS作为实验材料，将L605和316LSS作为对比材料。将样品加工成直径为10 mm，厚度为1 mm的薄片，经水磨砂纸逐级打磨抛光后，酒精超声清洗并吹干。实验前，将样品在121℃高温下灭菌20 min，烘干后备用。

1.2 溶血率实验

本实验严格依照GB/T 16886.4的标准执行[14]。实验用血为沈阳血液中心提供的新鲜人血，并添加抗凝剂。每种样品设置5个平行样，分别置于离心管中，按照样品面积与溶液体积为3 cm2/mL的比例分别加入1 mL的0.9%NaCl溶液，阴性对照为同体积的0.9% NaCl溶液，阳性对照为同体积的蒸馏水。将所有样品放入37℃恒温培养箱中培养30 min后，按照0.2 mL/10 mL加入稀释人血（人血与0.9% NaCl以4：5比例稀释）。在恒温培养箱中继续培养

60 min后，经3000 r/min速率离心5 min后取上清液，并加入至96孔板中，用酶标仪在545 nm波长处测量光密度（OD）值。溶血率计算公式如下：

式中：OD实验组——实验组样品的吸光度值；OD阴性组——阴性对照的吸光度值；OD阳性组——阳性对照的吸光度值。

1.3 细胞培养

实验中采用人脐动脉平滑肌细胞（HUASMC），对材料与细胞的相互作用展开研究。HUASMC购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。将细胞培养于含10%胎牛血清（BI，美国）和0.5%青链霉素（Gibico，美国）的1640培养基（Hyclone，中国）中，并置于含5%CO2，37℃/95%湿度条件的培养箱中，待细胞生长覆盖培养皿的80%时传代。加入含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化细胞并收集细胞至5 mL离心管中，1000 rpm离心5 min后，弃上清液，加入一定量培养基备用。

1.3.1 材料对HUASMC增殖率的影响

将材料置于48孔板中，取浓度为1×104/mL的细胞悬液100 μL接种于样品表面，培养8 h待细胞贴壁后，加入1640培养基，并培养1、3和5 d，同时设置阴性对照（完全培养基）。到了既定时间点，加入含EDTA的0.25%胰蛋白酶将样品表面细胞消化下来，1000 rpm离心5 min后，弃净上清液，加入100 μL 1640培养基重悬细胞后加入至96孔板中，加入10 μL MTS（Signalway，美国），在培养箱中继续孵育4 h后，在酶标仪490 nm波长下测量OD值，并计算细胞相对增殖率（Relative Growth Rate，RGR），计算公式为：

式中：OD实验组是实验组吸光度值；OD阴性组是阴性对照组吸光度值。

1.3.2 材料对HUASMC黏附的影响

将实验材料置于48孔板中，取浓度为1×104/mL的细胞悬液接种于材料表面，在CO2培养箱中培养1、3和5 d。达到既定时间后，取出样品，经PBS清洗3次，4%多聚甲醛固定细胞15 min，PBS再次浸洗3次后，使用DAPI（碧云天，中国）对细胞核进行染色，并在荧光显微镜（BK-6000，中国）下拍照。

1.4 统计学分析

采用SPSS 20.0统计学软件进行统计学分析。每种材料测试3个以上样品，结果用平均值±标准差表示。采用ANOVA方法进行整体性差异评价，方差齐性用LSD法进行组间比较；方差不齐用Dunnett’s T3法进行组间比较，P＜0.05为具有显著统计学差异，P＞0.05为无显著统计学差异。

2 结果

2.1 溶血率

3种材料的溶血率（图1）均小于5%。根据国标可知，若材料的溶血率＜5%，则说明材料符合医用材料的溶血试验要求，若溶血率≥5%，则说明材料有溶血作用。由此可见，3种材料均符合医用材料的溶血试验要求，且HNNFS的溶血率明显低于316L SS，与L605无统计学差异。

图1 HNNFS与L605、316LSS的溶血率

2.2 材料对HUASMC的影响

2.2.1 细胞相对增殖率

HUASMC分别在HNNFS、L605及316LSS表面上共培养1、3、5 d后，细胞的相对增殖率结果，见图2。由图可知，培养1 d时，3种材料表面细胞增殖率相近；当培养3 d后，HNNFS表面细胞相对增殖率明显低于L605和316LSS，体现出了优异的抑制平滑肌细胞增殖的能力。

2.2.2 细胞黏附

HUASMC在3种材料表面培养1、3、5 d后的黏附情况，见图3。随着培养时间的延长，HUASMC在L605及316LSS表面数量增加，表明细胞不断在材料表面增殖；而HNNFS表面黏附的细胞数量明显减少，展示了其对HUASMC增殖具有明显的抑制作用。

采用Image J软件，对每个实验样品随机选择5个视野计数，并进行统计学分析，发现HNNFS与L605和316L SS表面粘附的细胞数量与细胞增值率结果趋于一致，结果见图4。

图2 HNNFS与L605、316LSS对HUASMC增殖率的影响

图3 HUASMC在HNNFS与L605、316LSS表面的粘附情况

图4 HUASMC在HNNFS与L605、316LSS表面的粘附数量

3 讨论

溶血试验是评价生物医用材料血液相容性最基本的方法。当生物材料植入人体与血液接触后，材料表面与红细胞接触后造成细胞膜的损害，血红蛋白释放到血浆中，发生溶血[15-16]。由于高氮无镍不锈钢是一种惰性金属材料，因此在体液环境中溶出的毒性金属离子量微少，对红细胞的破坏微弱，不易发生溶血。此外，与L605和316L不锈钢相比，由于屏蔽了有害镍离子对溶血的促进作用，因此高氮无镍不锈钢显示出更优异的抗溶血性能[17]。

临床研究表明[18-20]，支架在植入人体后，对血管壁造成的损伤、炎症反应会导致血管平滑肌细胞的过度增殖以及血栓形成，从而引起血管支架内再狭窄。Koster等[21]研究了镍、铬和钼等金属离子释放引起的过敏反应与支架内再狭窄之间的关系，认为金属离子（特别是Ni）引起的接触过敏加重了炎症反应，刺激了支架周围新生组织的增生，从而增加了支架内再狭窄的可能性。另有研究认为镍是慢性难治性支架内再狭窄的主要原因之一[22-24]。因此，研究支架材料对平滑肌细胞增殖的影响起着至关重要的作用。有研究证明[25]，HNNFS表面培养的HUASMC的凋亡比率高于316LSS，通过Real-time PCR检测细胞凋亡基因，提示HNNFS可能通过外源性和内源性两种途径全面介导HUASMC的凋亡，从而抑制平滑肌细胞的增殖。

本文通过细胞增殖率、细胞黏附实验，对比研究了3种实验材料对人脐动脉平滑肌细胞增殖情况的影响，实验数据表明，与L605和316L SS相比，HNNFS对于平滑肌细胞具有显著的抑制作用。这一观察结果与上述研究结果一致。本研究的实验结果和结论尚处于初级阶段，支架内再狭窄是一个非常复杂的过程，高氮无镍不锈钢材料对支架内再狭窄影响的机理需要进一步研究。

4 结论与展望

目前，包括中国的很多国家已经下调了医用不锈钢中Ni的标准含量，并发布了医用无镍不锈钢标准。高氮无镍不锈钢作为一种新型的生物医用材料，由于其不含Ni元素，且具有优异的综合性能，在多个领域中已经取得重要进展。作为冠脉支架植入材料，高氮无镍不锈钢具有良好的血液相容性，同时对血管平滑肌细胞的增殖具有一定的抑制作用，对降低支架植入后引起的再狭窄具有十分重要的意义。

相较传统不锈钢，无镍不锈钢具有更优异的物理性能、化学性能及生物相容性，近些年仍会是医用金属材料的研究热点。随着对无镍不锈钢的生物安全性和力学性能等相关基础性研究的不断深入进行及逐步优化，医用高氮无镍不锈钢将会逐渐取代传统医用不锈钢，推动具有自主知识产权的新型医用不锈钢的临床应用。

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