空气霉菌总数测定方法分析

刘剑，刘艳芳，杨玉萍，王冲文，戈帆

（国营第二九八厂，昆明 650114）

霉菌在武器装备上生长时，新陈代谢分泌的有机酸会腐蚀红外材料、金属、橡胶等，分泌的水分会增加机壳内湿度，从而影响装备的力学性能和外观、导致电子装置短路、光学装置精度降低等。红外光学薄膜中的碳膜还为霉菌提供了丰富的碳源，为霉菌腐蚀创造了条件[1]。目前，霉菌腐蚀已成为武器装备常见的腐蚀之一，更是光学仪器三害之一，尤其在高温高湿环境中，霉菌生长条件适宜，繁殖速度快，空气霉菌含量高，武器装备长霉的概率也相应增加，加速了霉菌对武器装备的腐蚀。由于红外材料及其涂镀件对霉菌腐蚀较为敏感，因此在高温高湿、适宜霉菌生长的环境中，检测空气霉菌总数可以监测空气霉菌数量变化情况，评估武器装备（尤其是红外产品）在贮存和使用过程中的长霉概率。同时也是空气霉菌采集、鉴定的基础，为防霉技术研究提供数据支撑。

西双版纳热带雨林自然环境试验站属于高温、高湿环境，霉菌生长旺盛，对站内贮存的武器装备试验样品腐蚀较为明显。对此，笔者进行了较长时间的空气霉菌总数监测和防霉研究。

GB/T 18204.3—2013《公共场所卫生检验方法第3部分：空气微生物》规定两种空气真菌总数测定方法——自然沉降法和撞击法[2]，最初采用自然沉降法进行空气霉菌总数测定。经过几次测定以及对相关文献的查阅，发现自然沉降法测定结果在定性和定量上缺乏准确性，通过奥梅梁斯基换算方程式（1）换算的结果没有体现 Stokes定律中相关因素对测定结果的影响。

式中：C为活菌粒子数，cfu/m3；N为经培养后平板上生长的菌落数；A为所用平板的面积，cm2；t为平板暴露时间，min。

为了更准确测定空气霉菌总数，购置了六级筛孔撞击式空气微生物采样器，用撞击法测定空气霉菌总数。目前对自然沉降法和撞击法的研究大多在室内进行，但文中开展的空气霉菌相关研究还涉及室外空气霉菌采集。文中将对两种采样方法在空气霉菌总数测定中的应用及测定结果进行比较，选择稳定性更高的方法进行测量，为防霉技术研究提供更为可靠的数据。

1 材料与方法

1.1 培养基和器材

试验以沙氏培养基作为空气霉菌采集载体，用到的主要器材有φ90 mm玻璃平板（购自云南新茂科研器材开发公司）、六级筛孔撞击式空气微生物采样器（购自美国 SKC公司）、高温高压灭菌锅（购自上海博讯实业有限公司医疗设备厂）、霉菌培养箱等（购自常州普天仪器制造有限公司）。

1.2 采样原理

自然沉降法是在地心引力作用下，空气中悬浮的带菌颗粒会随时间的延长逐渐沉降[3]，降落在自然沉降法采样使用的营养琼脂平板表面上。撞击法是采用撞击式空气微生物采样器采样，通过抽气动力作用，使空气通过狭缝或小孔而产生高速气流，使悬浮在空气中的带菌粒子撞击到营养琼脂平板上。

1.3 采样

在昆明室内、室外，西双版纳室外各选择一个采样点，分别标记为1#，2#，3#，在同一采样点的同一时间段，用自然沉降法和撞击法测定空气霉菌总数。由于撞击式空气微生物采样器产生高速气流能更快地收集空气微生物，采样时间设计时撞击法多一个梯度。在昆明用自然沉降法测定空气霉菌总数的空气采集时间以5，10，15 min为梯度，撞击法以2，5，10，15 min为梯度进行采样。西双版纳属于典型热带雨林气候，霉菌生长旺盛，只能进行短时间的采样，所以自然沉降法以1 min为空气采集时间，撞击法以0.5，1 min为梯度进行采样。两种采样方法均以1.5 m为采样高度。在同一采样点用同一种方法按同一采样时间采集的样品为一组，每组设置三个平行样品。采集了空气霉菌的平板倒置在（28±1）℃的恒温培养箱中培养。

表1 采样计划

1.4 计数与计算

随培养时间延长，采样平板上的霉菌逐渐长大，形成菌落，如图2所示。培养至第3，5，7天时进行计数，获得各皿平板霉菌菌落总数。通过格鲁布斯检验式（2）求出Gi，取置信区间为99%，临界值G99（3）=1.15，即Gi＞1.15，则判定为离群值，应舍去；Gi＜1.15，则判定为正常值。平行样品的平均值即为最终平板生长的霉菌菌落数，自然沉降法按奥梅梁斯基公式换算成空气霉菌总数，撞击法按式（3）计算，以cfu/m3表示计算结果。

式中：Xi为样本中的可疑值；X为样本平均值；S为样本标准差。

式中：N 为经培养后平板上生长的菌落数；t为采样时间。

2 结果与讨论

2.1 平板计数结果

按表1采集17组空气样本，每组3个平行样，共获得51皿采集了空气样本的平板。经过三次计数，获得平板上生长的霉菌菌落数，自然沉降法采样计数结果见表2，撞击法采样计数结果见表 3，并计算各组霉菌菌落数的变异系数CV。

由表2可以看出，用自然沉降法采样的7组试验最大变异系数1.14，最小0.458，平均0.704。由表3可以看出，用撞击法采样的10组试验最大变异系数0.948，最小 0.093，平均 0.375。可见撞击法采样计数结果的变异系数比沉降法小。

1#为室内采样，2#为室外采样。由图3可以看出，在室内用沉降法采样时，计数结果的变异系数基本不受采样时间影响，但在室外，随采样时间的增加，变异系数在逐渐减小。用撞击法在室内外采样计数结果的变异系数均随采样时间的增加呈下降趋势，但在室内采样的变化较小。变异系数反应了数据的离散程度，由于室外空气流动较快，致使采样结果较分散，但根据环境条件适当增加采样时间，有利于降低数据的离散程度。

表2 自然沉降法采样计数结果

表3 撞击法法采样计数结果

2.2 格鲁布斯验证

为了剔除离群值，用格鲁布斯检验法对平板计数结果进行检验，三个平行样品中与平均值偏差最大的值视为可疑值，用式（2）检验是否属于离群值。检验结果见表4和表5。

经检验，自然沉降法在1#采样点采样5 min的数据有一个离群值，撞击法在2#采样点采样2 min的数据有一个离群值，剔除这两个数据后再计算空气中霉菌总数。两个离群值均是在较短采样时间产生的，而较长时间的采样均未出现离群值，故适当增加采样时间能降低瞬时环境因素对采样结果的影响。

表4 自然沉降法采样检验结果

表5 撞击法法采样检验结果

2.3 空气霉菌总数计算

将自然沉降法和撞击法采样计数结果换算成每立方米的空气霉菌总数。由图4可看出，沉降法在室内采样计算结果比撞击法高出许多，但在室外，两种采样方法比较接近。在室内，随采样时间的增加，两种方法采样结果都呈下降趋势，沉降法减少量更大。在室外，沉降法采样结果随时间增加有略微上升，而撞击法的变化量很小。3#采样点用撞击法采样0.5 min和1 min的结果差异较大，是因为1 min采集到霉菌太多，生长慢的霉菌在第二次计数时已被覆盖，所以结果偏小。

总体来说，无论在室内还是室外采样，在15 min的采样时间内，撞击法受采样时间的影响较小。两种方法在室外采样结果也比较接近，所以撞击法也是可以用于室外空气霉菌采样的。3#采样点空气霉菌数量较多，用撞击法只能进行0.5 min的采样。

3 结论

通过对比自然沉降法和撞击法采样结果，撞击法计数结果的变异系数较小，平行样相对离散程度较低，重复试验的结果较稳定。

适当增加采样时间，有利于降低数据的离散程度，但在空气霉菌总数未知的环境中，只能凭经验选定采样时间。撞击法采样结果受采样时间影响较小，可以降低因选择的采样时间较短引起的试验误差。

两种方法在室外测定空气霉菌总数的结果比较接近，但撞击法采样的计数结果变异系数小，受采样时间影响小。说明撞击法测定空气霉菌总数稳定性更好，测定空气霉菌总数可以尽量选用撞击法。

参考文献：

[1] 杨玉萍, 字正华, 钟辉, 等. 霉菌对Ge、Zns和Znse膜层的影响[J]. 红外技术, 2016, 38(12): 1078.

[2] GB/T 18204.3—2013, 公共场所卫生检验方法 第3部分: 空气微生物[S] .

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[4] 钟嶷, 郭重山, 李小晖, 等. 自然沉降法和撞击法在空气细菌总数测定中的应用和比较[J]. 环境与健康杂志,2004, 21(3): 149-152.

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[11] GB 4789. 2—2010, 食品微生物学检验 菌落总数测定[S] .