附子不同炮制品对麻黄细辛附子汤指纹图谱的影响研究

孙 红，韩 旭，王冠杰，邱丽丽，李 灿，容 蓉

(山东中医药大学，山东 济南 250355 )

麻黄细辛附子汤具有悠久历史，张仲景在伤寒论中写道“少阴病，反发热，脉沉者，麻黄细辛附子汤主之。”由此可见，该方主要用于治疗体质阳虚，外感风寒者，可温经解表。方中药材正如其名，以麻黄为君药，加以臣药附子佐药细辛配伍，具有宣上温下开窍启闭之功。现代临床多用于抗炎，抑制哮喘病发作，免疫调节[1]等。本方由麻黄(HerbaEphedrae)，细辛(RadixEtRhizomaAsari)附子(RadixAconitiLateralisPraeparata)三味中药组成[2]。其中附子有不同炮制规格且因地而异，因此使用不同炮制规格的附子对制成的麻黄附子细辛汤制剂的质量控制研究具有重要意义，因此研究不同炮制规格附子对麻辛附汤溶出度的影响具有重大意义。本文运用高效液相色谱制作分别含有白附片，淡附片，黑顺片，炮附子四种附子麻黄附子细辛汤的指纹图谱，以炮附子指纹图谱为参照图谱，通过指纹图谱的对比分析，进一步研究不同炮制规格的附子对麻黄附子细辛汤的质量影响。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1260型高效液相色谱仪；十万分之一电子分析天平(上海精密仪器有限公司)；台式高速离心机(TGL-16G,上海医用分析仪器厂)；电热恒温水文箱(北京医疗设备厂)。

1.2 试药

麻黄为麻黄科植物草麻黄( Ephedra sinica Stapf．)的干燥草质茎(产地内蒙古)，炮附子、黑顺片、淡附片、白附片为毛茛科植物乌头(Aconitum carmichaeli Debx．)子根的加工品(产地四川)，细辛为马兜铃科植物北细辛(Asarum heterotropoldes Fr．Schmidt var．Mandshuricum ( Maxim．) Kitag．)的干燥根及根茎(产地吉林)，以上药材经山东中医药大学李峰教授鉴定，均符合《中国药典》2015 年版标准。甲醇(色谱纯，国药集团化学试剂有限公司)，水(娃哈哈纯净水)，磷酸(天津科密欧化学试剂有限公司)。

2 方法与结果

2.1 麻黄细辛附子汤指纹图谱的建立

2.1.1 色谱条件

色谱柱：Eclipse XDB-C18(4.6×250 mm,5μm，美国安捷伦公司)；流动相：甲醇(A)-0.2%磷酸水溶液(B)；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：254nm；柱温：30℃；进样量：20μL；采用梯度洗脱，梯度变化条件见表1。

表1 HPLC梯度变化条件

2.1.2 麻黄细辛附子汤的制备

分别取炮附子、黑顺片、淡附片、白附片按传统处方比例麻黄∶细辛∶附子=2∶1∶3[3]，即取麻黄6 g，细辛3 g，附子9 g，用水浸泡30min，加16倍水回流提取两次，每次1 h，提取液水浴浓缩，浓缩液离心15min(4000 r/min)，定容至50 mL，4 ℃保存备用。

2.1.3 供试品溶液的制备

分别取炮附子、黑顺片、淡附片、白附片的样品液各3mL，加无水乙醇定容至10 mL，静置过夜。过滤，取续滤液5 mL于蒸发皿中，水浴浓缩至干，加蒸馏水溶解，分别转移至5mL容量瓶中，定容至刻度，得供试品溶液。

2.1.4 麻黄细辛附子汤指纹图谱

分别吸取2.1.3项下炮附子、黑顺片、淡附片、白附片的供试品溶液，以2.1.1项下的色谱条件进样，记录4种附子炮制品的HPLC指纹图谱。将所得的指纹图谱以AIA的形式保存，导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2004A 版)，分析处理后共得到7个共有指纹峰。结果如图1。

S1-白附片；S2-淡附片；S3-黑顺片；S4-炮附子

图1 附子不同炮制品麻黄细辛附子汤指纹图谱

2.1.5 方法学考察

2.1.5.1 精密度试验

取同一份供试品溶液以2.1.1项下的色谱条件，在一定时间内连续进样五次，记录下它们的指纹图谱。采用“中药指纹图谱相似度评价系统”(2004A 版)对指纹图谱中7个共有指纹峰的相对保留时间和相对保留峰面积进行计算，相对保留时间的RSD%范围在0.005%～0.089%，相对保留峰面积的RSD%范围在1.024%～2.072%。表明仪器的精密性良好。具体数值见表2。

2.1.5.2 重现性实验

取同一供试品溶液5份以2.1.1项下的色谱条件进样，记录下它们的指纹图谱。将所得的指纹图谱的数据采用2.1.5项下(1)中的软件对指纹图谱中7个共有指纹峰的相对保留时间和相对保留峰面积进行计算，相对保留时间的RSD%范围在0.012%～0.093%，相对保留峰面积的RSD%范围在1.022%～1.912%。表明实验的重现性良好。具体数值见表2。。

2.1.5.3 稳定性实验

取同一供试品溶液分别在放置0,2,4,8,12,24 h后以2.1.1项下的色谱条件进样，记录下它们的指纹图谱。将所得的指纹图谱的数据采用2.1.5项下(1)中的软件对指纹图谱中7个共有指纹峰的相对保留时间和相对保留峰面积进行计算，相对保留时间的RSD%范围在0.057%～0.163%，相对保留峰面积的RSD%范围在1.254%～2.192%。表明实验的稳定性良好。具体数值见表2。

表2 方法学考察中各主要峰的相对保留时间(Rt)和相对保留面积(Ra)

2.2 附子不同炮制品对麻黄细辛附子汤指纹图谱的影响

2.2.1 指纹图谱的相似度计算

表3 附子不同炮制品相似度计算结果

将4种附子炮制品的麻黄细辛附子汤指纹图谱导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2004 A版)，参照图谱使用炮附子的麻黄细辛附子汤的指纹图谱，对附子不同炮制品的麻黄细辛附子汤指纹图谱进行相似度分析，对7个共有指纹峰进行匹配，再通过平均数计算的方法，进一步得出附子不同炮制品麻黄细辛附子汤指纹图谱的共有模式，并以次为规范，进行相似度的整体评价。相似度计算结果见表3。

从表3可以看出，附子不同炮制品的麻黄细辛附子汤指纹图谱相似度均大于0.90，说明附子不同炮制品的麻黄细辛附子汤色谱模式相似，其化学成分一致性较好。但仍存在差异，三种炮制附子与炮附子麻黄细辛附子汤指纹图谱相似度相比有明显差别，同时不同炮制品之间的相似度也存在差异。其中，白附片与炮附子的相似度最高，达到98.3%，淡附片与炮附子的相似度最低，为90.5%。

2.2.2 附子不同炮制品对麻黄细辛附子汤指纹图谱的影响分析

在共有指纹峰中，以4号峰为参照峰，计算各峰的相对保留峰面积，用炮附子的麻黄细辛附子汤指纹图谱为参照图谱。结果见表4。

表4 附子不同炮制品的相对峰面积

分析结果表明，附子不同炮制品对麻黄细辛附子汤指纹图谱的影响具有一定的差异性。以临床常用的炮附子指纹图谱为参照图谱，其中，白附片、淡附片、黑顺片麻黄细辛附子汤指纹图谱的2、3号峰面积均稍小于炮附子，5、7号峰面积均显著大于炮附子；而在1号峰峰面积比较中，白附片及黑顺片峰面积都小于炮附子，仅淡附片峰面积大于炮附子；在6号峰峰面积比较中，淡附片及黑顺片峰面积都大于炮附子，且淡附片峰面积显著增大，而白附片峰面积小于炮附子。

3 讨论

中药指纹图谱可整体地反映出复方中各化学成分的变化状况，从而进一步反映出各种药材之间的相互作用关系。在中药材质量评价方面的作用和地位得到了社会广泛的认可。

本研究以炮附子麻黄细辛附子汤指纹图谱为参照图谱，研究白附片、淡附片、黑顺片对麻黄细辛附子汤指纹图谱的影响。通过相似度计算可知，白顺片与炮附子指纹图谱最为相似，化学成分较相似，则其麻黄细辛附子汤临床药效也将最为相近。而淡附片、黑顺片与炮附子相似度则较差，说明二者炮制方法较大地改变了化学成分。

附子不同炮制品的麻黄细辛附子汤指纹图谱存在较多数共有指纹峰，且大多数共有指纹峰的峰面积比较大，说明附子不同炮制品对麻黄细辛附子汤化学成分的影响处在较稳定的范围，这为麻黄细辛附子汤不同炮制品的临床应用的疗效奠定了一定的基础。而药材经过炮制造成麻黄细辛附子汤化学成分之间有所差异，因此表现在图谱上是同一保留时间上的峰面积不同，进而表现出临床疗效将有所差别。本实验发现附子不同炮制品麻黄细辛附子汤指纹图谱存在差异，与炮附子相比，白附片、淡附片、黑顺片的共有峰峰面积均发生变化，这些共有峰是哪一种成分未知，为进一步的研究提供了依据。

参考文献

[1]王艳宏,包 蕾,刘振强,等. 麻黄附子细辛汤药理作用研究进展[J]. 时珍国医国药,2010,21(1):216-217.

[2]张俊斐,赵浩如. RP-HPLC法测定麻黄附子细辛汤水煎液中麻黄碱的含量[J]. 海峡药学,2009,21(3):41-43.

[3]王小平.麻黄细辛附子汤抗病毒活性部位及其血清指纹图谱研究[D].济南：山东中医药大学,2010:46.